Multiphoton מיקרוסקופי של מוח העכבר הותר הבעת YFP
Summary
מיקרוסקופיה multiphoton של איברים שלמים עכבר ניתן על ידי ניקוי האיברים אופטיים לפני ההדמיה, אך לא כל הפרוטוקולים לשמר את אות הניאון של חלבוני ניאון. באמצעות שיטה אופטית סליקה עם התייבשות אתנול מבוסס ואלכוהול בנזיל: סליקה בנזואט נזיל, אנחנו מראים תמונות multiphoton ברזולוציה גבוהה של כל המוח של עכבר מביע YFP.
Abstract
מיקרוסקופיה multiphoton של הדור הפנימי פלואורסצנטי וההרמוניה השני (SHG) של איברי עכבר שלמים מתאפשרת על ידי ניקוי האיברים אופטיים לפני ההדמיה. 1,2 עם זאת, עבור איברים המכילים חלבוני ניאון כגון GFP וYFP, פרוטוקולי סליקה אופטיות המשתמשים במתנול התייבשות וברורה שימוש באלכוהול בנזיל: נזיל בנזואט (באב) ואילו לא מוגן מאור 3 לא לשמר את אות הניאון. הפרוטוקול המובא כאן הוא דרך חדשה שבה לבצע סליקה אופטית איבר שלמה במוח עכבר תוך שמירה על אות הקרינה של YFP מתבטאת בתאי עצב. שינוי פרוטוקול סליקה האופטי כזה שהאיבר הוא התייבשות באמצעות סדרה מדורגת אתנול כבר נמצא כדי להפחית את הניזק לחלבוני ניאון ולשמר את אות הניאון להדמית multiphoton. 4 שימוש בשיטה אופטימלית של סליקה אופטית עם התייבשות אתנול מבוסס ו סליקה על ידי אבבעוד מוגן מפני אור, אנחנו מראים תמונות multiphoton רזולוציה גבוהה של חלבון ביטוי ניאון צהוב (YFP) בתאי העצב של מוח יותר מ 2 מ"מ עכבר מתחת לפני שטח הרקמות.
Protocol
Discussion
אמנם צבעים אורגניים תקניים תואמים למגוון רחב של ממסים אורגניים, ולכן לא מהווים אתגר מיוחד לניקוי פרוטוקולים, חלבוני ניאון הם בדרך כלל פחות סובלניים לשינויים בממס. 4 המטרה של העבודה הנוכחית היה להתגבר על מגבלה רצינית של פרוטוקולים קודמים אופטיים סליקה שבו קרינה…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות ליעקב סוליס לעזרתו בעריכת וידאו.
עבודה זו מומנה בחלק פרס NSF קריירת DBI-0953902 לMJ לוין על ידי.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, Inc. | D8537 | 500 ml, pH 7.2 |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 10 x 10 ml, 16% paraformaldehyde |
| Ethyl alcohol | American Bioanalytical | AB00515-00500 | 500 ml, 200 proof |
| Ethyl alcohol | Pharmco Products, Inc. | 111000190 | 1 gal., 190 proof |
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich, Inc. | 402834 | 500 ml, 99+% |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich, Inc. | B6630-IL | 500 ml, ≥ 99% |
| 5X/0.5 NA objective | Nikon | AZ Plan Flour 5X | 15 WD |
References
- Parra, S. G., Chia, T. H., Zinter, J. P., Levene, M. J. Multiphoton microscopy of cleared mouse organs. J. Biomed. Opt. 15, 036017 (2010).
- Vesuna, S., Torres, R., Levene, M. J. Multiphoton fluorescence, second harmonic generation, and fluorescence lifetime imaging of whole cleared mouse organs. J. Biomed. Opt. 16, 106009 (2011).
- Zucker, R. M. Whole insect and mammalian embryo imaging with confocal microscopy: Morphology and apoptosis. Cytometry. A69, 1143-1152 (2006).
- Sakhalkar, H. S. Functional imaging in bulk tissue specimens using optical emission tomography: Fluorescence preservation during optical clearing. Phys. Med. Biol. 52, 2035-2054 (2007).
- Dazai, J., Spring, S., Cahill, L. S., Henkelman, R. M. Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging. J. Vis. Exp. (48), e2497 (2011).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed. Eng. Online. 2, (2003).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2001).
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
- Feng, G., Mellor, R. H., Bernstein, M., Keller-Peck, C., Nguyen, Q. T., Wallace, M., Nerbonne, J. M., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Hama, H. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neuro. 14, 1481-1488 (2011).
