Multiphoton المجهر من مخ الفأر مسح تعرب عن YFP
Summary
المجهر Multiphoton من أجهزة الماوس كله هو ممكن عن طريق مسح ضوئيا الجهاز قبل التصوير، ولكن ليس كل البروتوكولات الحفاظ على إشارة الفلورسنت من البروتينات الفلورية. باستخدام أسلوب المقاصة البصرية مع الايثانول القائمة على الجفاف وكحول البنزيل: بنزيل بنزوات المقاصة، وتبين لنا صور عالية الدقة multiphoton من مخ الفأر كله معربا عن YFP.
Abstract
يتم توليد المجهر Multiphoton الجوهرية التوافقي مضان والثانية (SHG) من أجهزة الماوس كله ممكن عن طريق مسح ضوئيا الجهاز قبل التصوير. 1،2 ومع ذلك، لأجهزة التي تحتوي على البروتينات الفلورية مثل GFP وYFP، وبروتوكولات تبادل المعلومات البصرية التي تستخدم الميثانول الجفاف واضحة باستخدام كحول البنزيل: بنزيل بنزوات (BABB)، في حين دون وقاية من 3 ضوء لا تحتفظ إشارة الفلورسنت. بروتوكول المعروضة هنا هي طريقة الرواية التي لأداء الجهاز كله المقاصة الضوئية على مخ الفأر مع الحفاظ على إشارة مضان من الخلايا العصبية التي أعرب عنها في YFP. تغيير بروتوكول تبادل المعلومات البصرية مثل أن الجهاز يعاني من الجفاف باستخدام الإيثانول سلسلة متدرجة وقد وجد للحد من الأضرار التي لحقت البروتينات الفلورية والحفاظ على إشارة الفلورسنت للتصوير multiphoton. 4 استخدام أسلوب الأمثل من المقاصة البصرية مع الايثانول القائمة على الجفاف و تطهير من BABBبينما محمية من الضوء، وتبين لنا صور عالية الدقة multiphoton من الفلورسنت الأصفر التعبير (YFP) البروتين في الخلايا العصبية لدماغ فأرة أكثر من 2 ملم تحت سطح الأنسجة.
Protocol
Discussion
بينما الأصباغ العضوية القياسية متوافقة مع مجموعة من المذيبات العضوية، وبالتالي لا تشكل تحديا خاصا لتطهير البروتوكولات والبروتينات الفلورية وغالبا ما تكون أقل تسامحا من التغييرات في المذيبات .. 4 والهدف من هذا العمل هو التغلب قيدا خطيرا من البروتوكولات السابق?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر يعقوب سوليس على مساعدته في تحرير الفيديو.
وقد تم تمويل هذا العمل في جزء من جائزة CAREER NSF-0953902 DBI ليفين MJ.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, Inc. | D8537 | 500 ml, pH 7.2 |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 10 x 10 ml, 16% paraformaldehyde |
| Ethyl alcohol | American Bioanalytical | AB00515-00500 | 500 ml, 200 proof |
| Ethyl alcohol | Pharmco Products, Inc. | 111000190 | 1 gal., 190 proof |
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich, Inc. | 402834 | 500 ml, 99+% |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich, Inc. | B6630-IL | 500 ml, ≥ 99% |
| 5X/0.5 NA objective | Nikon | AZ Plan Flour 5X | 15 WD |
References
- Parra, S. G., Chia, T. H., Zinter, J. P., Levene, M. J. Multiphoton microscopy of cleared mouse organs. J. Biomed. Opt. 15, 036017 (2010).
- Vesuna, S., Torres, R., Levene, M. J. Multiphoton fluorescence, second harmonic generation, and fluorescence lifetime imaging of whole cleared mouse organs. J. Biomed. Opt. 16, 106009 (2011).
- Zucker, R. M. Whole insect and mammalian embryo imaging with confocal microscopy: Morphology and apoptosis. Cytometry. A69, 1143-1152 (2006).
- Sakhalkar, H. S. Functional imaging in bulk tissue specimens using optical emission tomography: Fluorescence preservation during optical clearing. Phys. Med. Biol. 52, 2035-2054 (2007).
- Dazai, J., Spring, S., Cahill, L. S., Henkelman, R. M. Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging. J. Vis. Exp. (48), e2497 (2011).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed. Eng. Online. 2, (2003).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2001).
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
- Feng, G., Mellor, R. H., Bernstein, M., Keller-Peck, C., Nguyen, Q. T., Wallace, M., Nerbonne, J. M., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Hama, H. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neuro. 14, 1481-1488 (2011).
