Multiphotonen Mikroskopie Cleared Maushirn Ausdruck YFP
Summary
Mehrphotonenmikroskopie ganzer Mausorganen ist durch optisches Löschen des Organs vor der Bildgebung möglich, aber nicht alle Protokolle bewahren das Fluoreszenzsignal von fluoreszierenden Proteinen. Unter Verwendung eines optischen Clearing-Methode mit Ethanol-basierte Austrocknung und Benzylalkohol: Benzylbenzoat Lichtung zeigen wir, hochauflösende Multiphotonen Bilder gesamte Gehirn der Maus zum Ausdruck YFP.
Abstract
Mehrphotonenmikroskopie intrinsischer Fluoreszenz und Erzeugung der zweiten Harmonischen (SHG) von ganzen Mausorganen ermöglicht wird. Durch optisches Löschen des Organs vor der Bildgebung 1,2 Jedoch für Organe, die fluoreszierende Proteine wie GFP und YFP enthalten, optische Clearing-Protokolle verwenden, die Methanol Austrocknung und klare Benzylalkohol: Benzylbenzoat (BABB), während ungeschützt Licht 3 nicht beibehalten das Fluoreszenzsignal. Das Protokoll präsentiert hier ist eine neue Art und Weise, in der ganzen Organs optische Lichtung am Gehirn der Maus ausführen, um unter Wahrung der Fluoreszenzsignal YFP ausgedrückt in Neuronen. Verändern der optischen Clearing-Protokoll, so dass das Organ dehydratisiert wird mit einem Ethanol abgestuften Serie wurde gefunden, um den Schaden an den fluoreszierenden Proteinen reduzieren und Erhaltung ihrer Fluoreszenzsignal für Mehrphotonen Bildgebung. 4 Verwendung eines optimierten Verfahren der optischen Lichtung mit Ethanolbasis Dehydratisierung und Clearing durch BABBwährend von Licht abgeschirmt wird gezeigt, hochauflösende Bilder der Multiphotonen gelb fluoreszierendes Protein (YFP)-Expression in den Neuronen einer Mäusehirn mehr als 2 mm unter der Gewebeoberfläche.
Protocol
Discussion
Während herkömmliche organische Farbstoffe kompatibel mit einer Reihe von organischen Lösungsmitteln sind, und daher nicht stellen eine besondere Herausforderung für das Clearing von Protokollen, sind fluoreszierende Proteine oft weniger tolerant Veränderungen in Lösungsmittel. 4 Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, eine ernsthafte Einschränkung zu überwinden bisherigen optischen Clearing Protokolle, bei denen Fluoreszenz XFPs verloren oder wurde stark beeinträchtigt. Die Bilder, die hier v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten Jacob Solis für seine Hilfe bei der Videobearbeitung danken.
Diese Arbeit wurde zum Teil durch einen NSF CAREER Award DBI-0953902 bis MJ Levene finanziert.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, Inc. | D8537 | 500 ml, pH 7.2 |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 10 x 10 ml, 16% paraformaldehyde |
| Ethyl alcohol | American Bioanalytical | AB00515-00500 | 500 ml, 200 proof |
| Ethyl alcohol | Pharmco Products, Inc. | 111000190 | 1 gal., 190 proof |
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich, Inc. | 402834 | 500 ml, 99+% |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich, Inc. | B6630-IL | 500 ml, ≥ 99% |
| 5X/0.5 NA objective | Nikon | AZ Plan Flour 5X | 15 WD |
References
- Parra, S. G., Chia, T. H., Zinter, J. P., Levene, M. J. Multiphoton microscopy of cleared mouse organs. J. Biomed. Opt. 15, 036017 (2010).
- Vesuna, S., Torres, R., Levene, M. J. Multiphoton fluorescence, second harmonic generation, and fluorescence lifetime imaging of whole cleared mouse organs. J. Biomed. Opt. 16, 106009 (2011).
- Zucker, R. M. Whole insect and mammalian embryo imaging with confocal microscopy: Morphology and apoptosis. Cytometry. A69, 1143-1152 (2006).
- Sakhalkar, H. S. Functional imaging in bulk tissue specimens using optical emission tomography: Fluorescence preservation during optical clearing. Phys. Med. Biol. 52, 2035-2054 (2007).
- Dazai, J., Spring, S., Cahill, L. S., Henkelman, R. M. Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging. J. Vis. Exp. (48), e2497 (2011).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed. Eng. Online. 2, (2003).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2001).
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
- Feng, G., Mellor, R. H., Bernstein, M., Keller-Peck, C., Nguyen, Q. T., Wallace, M., Nerbonne, J. M., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Hama, H. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neuro. 14, 1481-1488 (2011).
