Sola célula de análisis de Bacillus subtilis Las biopelículas mediante microscopía de fluorescencia y citometría de flujo
Summary
Biopelículas microbianas están constituidas generalmente por distintas subpoblaciones de células especializadas. Sola célula de análisis de estas subpoblaciones requiere el uso de reporteros fluorescentes. A continuación se describe un protocolo para visualizar y controlar varias subpopulationswithin<em> B. subtilis</em> Biopelículas utilizando microscopía de fluorescencia y citometría de flujo.
Abstract
La formación de biopelículas es un atributo general a casi todas las bacterias 1-6. Cuando las bacterias forman biopelículas, las células están encerradas en una matriz extracelular que está mayoritariamente constituida por las proteínas y exopolisacáridos, entre otros 7-10. La comunidad microbiana encerrado dentro de la biopelícula a menudo muestra la diferenciación de las distintas subpoblaciones de células especializadas 11-17. Estas subpoblaciones coexisten y se muestran a menudo la organización espacial y temporal dentro del biofilm 18-21.
La formación de biopelículas en los Bacillus subtilis organismo modelo requiere la diferenciación de las distintas subpoblaciones de células especializadas. Entre ellos, la subpoblación de los productores de matriz, responsables de producir y secretar la matriz extracelular de la biopelícula es esencial para la formación de biopelículas 11,19. Por lo tanto, la diferenciación de los productores de la matriz es una característica de la formación de biopelículas en la B. subtilis.
Hemos utilizado los reporteros fluorescentes para visualizar y cuantificar la subpoblación de los productores de la matriz en las biopelículas de B. subtilis 15,19,22-24. Concretamente, hemos observado que la subpoblación de los productores de matriz diferencia en respuesta a la presencia de auto-producido señal extracelular surfactina 25. Curiosamente, surfactina es producida por una subpoblación de células especializadas diferentes de la subpoblación de los productores de matriz 15.
Hemos expuesto en este informe, el enfoque técnico necesario para visualizar y cuantificar la subpoblación de los productores de la matriz y los productores de surfactina en las biopelículas de B. subtilis. Para hacer esto, los reporteros fluorescentes de los genes necesarios para la producción de matriz y la producción de surfactina se insertan en el cromosoma de B. subtilis. Los reporteros se expresan únicamente en una subpoblación de células especializadas. Entonces, las subpoblaciones puede sercontrolará mediante microscopía de fluorescencia y citometría de flujo (ver Fig. 1).
El hecho de que diferentes subpoblaciones de células especializadas coexisten dentro de las comunidades de bacterias multicelulares nos da una perspectiva diferente sobre la regulación de la expresión génica en procariotas. Este protocolo trata este fenómeno de manera experimental y puede ser fácilmente adaptado a cualquier modelo de otros tratamientos, para dilucidar los mecanismos moleculares que subyacen a la heterogeneidad fenotípica dentro de una comunidad microbiana.
Protocol
Discussion
El hecho de que las comunidades bacterianas muestran las subpoblaciones de células que expresan el conjunto específico de genes evidencia la complejidad de las comunidades microbianas 33,34. Este protocolo debe ayudar a determinar si la expresión de cualquier gen de interés se limita a una subpoblación particular de células especializadas dentro de la comunidad microbiana. La visualización de estas subpoblaciones requiere el desarrollo de nuevas técnicas, porque los métodos tradicionales para control…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo está financiado por el Programa de Investigación Investigador Joven, del Centro de Investigación de Enfermedades Infecciosas (Zinf) de la Universidad de Würzburg. Juan C García-Betancur es un compañero de doctorado de la Escuela de Graduados en Ciencias de la Vida (GSL) de la Universidad de Würzburg.
Materials
| Technique | Name of the reagent | Company | Catalog number |
| MSgg composition | potassium phosphate 5mM | Roth | 6878 |
| MOPS 100mM | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| Magnesium chloride 2mM | Roth | 2189.1 | |
| Calcium chloride 700μM | Roth | A119.1 | |
| Ferric chloride 50μM | Sigma-Aldrich | 157740 | |
| Zinc chloride 1μM | Applichem | A2076 | |
| Thiamine 2μM | Sigma-Aldrich | 74625 | |
| Glycerol 0.5% | Roth | 7533 | |
| Glutamate 0.5% | Sigma-Aldrich | 49621 | |
| Tryptophan 50μg/ml | Sigma-Aldrich | T0254 | |
| Phenylalanine 50μg/ml | Sigma-Aldrich | P2126 | |
| Cell fixation | Paraformaldehyde | Roth | 0335 |
| Name of the equipment | Company | Catalog number | |
| Sonication | Cell Sonicator | Bandelin | D-1000 |
| Fluorescence Microscopy | Fluorescence Microscope | Leica | DMI6000B |
| Name of the software | Company | Catalog Number | |
| Fluorescence Microscopy | AsaF | Leica | |
| Flow cytometry | FCASDiva | BD | |
| Flow cytometry | FlowJo | Treestar |
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