מתא בודד ניתוח בצילוס subtilis Biofilms באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ו cytometry זרימה
Summary
Biofilms חיידקים הם בדרך כלל מהווים ידי subpopulations שונים של תאים מיוחדים. מתא בודד ניתוח subpopulations אלה מחייב שימוש כתבים ניאון. כאן אנו מתארים את פרוטוקול לחזות ולפקח subpopulationswithin כמה<em> ב subtilis</em> Biofilms באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ו cytometry הזרימה.
Abstract
היווצרות biofilm היא תכונה כללית כמעט כל 1-6 חיידקים. כאשר חיידקים ליצור biofilms, תאים נארזים תאי מטריקס כי היא היוותה בעיקר על ידי חלבונים exopolysaccharides, בין היתר 7-10. קהילת חיידקים עטוף בתוך biofilm לעיתים קרובות ניתן לראות את הבידול של subpopulation מובהק של תאים מיוחדים 11-17. Subpopulations אלה לדור בכפיפה אחת, ולעתים קרובות להראות ארגון במרחב ובזמן בתוך biofilm 18-21.
היווצרות biofilm ב האורגניזם subtilis מודל בצילוס דורש בידול של subpopulations שונים של תאים מיוחדים. ביניהם, subpopulation של מפיקי מטריקס, אחראי לייצר ולהפריש תאי מטריקס של biofilm הוא חיוני ליצירת biofilm 11,19. לפיכך, בידול של מפיקי מטריקס היא סימן ההיכר של היווצרות biofilm ב B. subtilis.
השתמשנו כתבים ניאון כדי לחזות ולכמת subpopulation של מפיקי מטריקס ב biofilms של B. subtilis 15,19,22-24. באופן קונקרטי, יש לנו ציין כי subpopulation של מפיקי מטריקס מבדיל בתגובה לנוכחות של האות בהפקה עצמית תאי surfactin 25. מעניין, surfactin מופק על ידי subpopulation של תאים מיוחדים שונים subpopulation של מפיקי מטריקס 15.
הפרדנו בדוח זה גישה טכנית צורך לדמיין ולכמת subpopulation של מפיקי מטריקס ומפיקים surfactin בתוך biofilms של subtilis ב. לשם כך, כתבים ניאון של הגנים הדרושים לייצור מטריקס ייצור surfactin מוכנסים לתוך כרומוזום של B. subtilis. עיתונאים באים לידי ביטוי רק subpopulation של תאים מיוחדים. לאחר מכן, subpopulations יכולים להיותמעקב באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי cytometry זרימה (ראה איור 1).
העובדה subpopulations שונים של תאים מיוחדים לדור בכפיפה אחת בתוך הקהילות תאיים של חיידקים נותן לנו נקודת מבט שונה על רגולציה של ביטוי גנים פרוקריוטים. פרוטוקול זה מטפל בתופעה בניסוי וניתן להתאים בקלות כל מודל עבודה אחר, כדי להבהיר את המנגנונים המולקולריים שבבסיס ההטרוגניות פנוטיפי בתוך קהילה של חיידקים.
Protocol
Discussion
העובדה קהילות חיידקי להראות subpopulations של תאים המבטאים קבוצה מסוימת של ראיות גנים המורכבות של קהילות מיקרוביאלי 33,34. פרוטוקול זה אמור לעזור לקבוע אם הביטוי של הגן בכל עניין מוגבל subpopulation מסוים של תאים מיוחדים בתוך הקהילה של חיידקים. ויזואליזציה של subpopulations אלה מחי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו ממומנת על ידי תוכנית מחקר לחוקר הצעיר, מהמרכז לחקר מחלות מדבקות (ZINF) מאוניברסיטת וורצבורג. חואן גרסיה C-Betancur הוא עמית דוקטורט בבית הספר ללימודי מוסמכים של מדעי החיים (GSLS) מאוניברסיטת וורצבורג.
Materials
| Technique | Name of the reagent | Company | Catalog number |
| MSgg composition | potassium phosphate 5mM | Roth | 6878 |
| MOPS 100mM | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| Magnesium chloride 2mM | Roth | 2189.1 | |
| Calcium chloride 700μM | Roth | A119.1 | |
| Ferric chloride 50μM | Sigma-Aldrich | 157740 | |
| Zinc chloride 1μM | Applichem | A2076 | |
| Thiamine 2μM | Sigma-Aldrich | 74625 | |
| Glycerol 0.5% | Roth | 7533 | |
| Glutamate 0.5% | Sigma-Aldrich | 49621 | |
| Tryptophan 50μg/ml | Sigma-Aldrich | T0254 | |
| Phenylalanine 50μg/ml | Sigma-Aldrich | P2126 | |
| Cell fixation | Paraformaldehyde | Roth | 0335 |
| Name of the equipment | Company | Catalog number | |
| Sonication | Cell Sonicator | Bandelin | D-1000 |
| Fluorescence Microscopy | Fluorescence Microscope | Leica | DMI6000B |
| Name of the software | Company | Catalog Number | |
| Fluorescence Microscopy | AsaF | Leica | |
| Flow cytometry | FCASDiva | BD | |
| Flow cytometry | FlowJo | Treestar |
References
- Costerton, J. W. Overview of microbial biofilms. J. Ind. Microbiol. 15, 137-140 (1995).
- Davey, M. E., O’Toole, G. A. Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64, 847-867 (2000).
- Kolenbrander, P. E. Oral microbial communities: biofilms, interactions, and genetic systems. Annu. Rev. Microbiol. 54, 413-437 (2000).
- O’Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. Biofilm formation as microbial development. Annu. Rev. Microbiol. 54, 49-79 (2000).
- Donlan, R. M. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerg. Infect. Dis. 8, 881-890 (2002).
- Lopez, D., Vlamakis, H., Kolter, R. Biofilms. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, a000398-a000398 (2010).
- Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. Biofilms: the matrix revisited. Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).
- Branda, S. S., Chu, F., Kearns, D. B., Losick, R., Kolter, R. A major protein component of the Bacillus subtilis biofilm matrix. Mol. Microbiol. 59, 1229-1238 (2006).
- Latasa, C., Solano, C., Penades, J. R., Lasa, I. Biofilm-associated proteins. C. R. Biol. 329, 849-857 (2006).
- O’Gara, J. P. ica and beyond: biofilm mechanisms and regulation in Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus aureus. FEMS Microbiol Lett. 270, 179-188 (2007).
- Chai, Y., Chu, F., Kolter, R., Losick, R. Bistability and biofilm formation in Bacillus subtilis. Mol. Microbiol. 67, 254-263 (2008).
- Chen, R., Guttenplan, S. B., Blair, K. M., Kearns, D. B. Role of the sigmaD-dependent autolysins in Bacillus subtilis population heterogeneity. J. Bacteriol. 191, 5775-5784 (2009).
- Guttenplan, S. B., Blair, K. M., Kearns, D. B. The EpsE flagellar clutch is bifunctional and synergizes with EPS biosynthesis to promote Bacillus subtilis biofilm formation. PLoS Genet. 6, e1001243-e1001243 (2010).
- Kearns, D. B., Losick, R. Cell population heterogeneity during growth of Bacillus subtilis. Genes Dev. 19, 3083-3094 (2005).
- Lopez, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. Paracrine signaling in a bacterium. Genes Dev. 23, 1631-1638 (2009).
- Veening, J. W., Smits, W. K., Hamoen, L. W., Jongbloed, J. D., Kuipers, O. P. Visualization of differential gene expression by improved cyan fluorescent protein and yellow fluorescent protein production in Bacillus subtilis. Appl. Environ. Microbiol. 70, 6809-6815 (2004).
- Veening, J. W., Smits, W. K., Hamoen, L. W., Kuipers, O. P. Single cell analysis of gene expression patterns of competence development and initiation of sporulation in Bacillus subtilis grown on chemically defined media. J. Appl. Microbiol. 101, 531-541 (2006).
- Veening, J. W., Kuipers, O. P., Brul, S., Hellingwerf, K. J., Kort, R. Effects of phosphorelay perturbations on architecture, sporulation, and spore resistance in biofilms of Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 188, 3099-3109 (2006).
- Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. Control of cell fate by the formation of an architecturally complex bacterial community. Genes Dev. 22, 945-953 (2008).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nat. Rev. Microbiol. 6, 199-210 (2008).
- Veening, J. W., Smits, W. K., Kuipers, O. P. Bistability, epigenetics, and bet-hedging in bacteria. Annu. Rev. Microbiol. 62, 193-210 (2008).
- Aguilar, C., Vlamakis, H., Guzman, A., Losick, R., Kolter, R. KinD is a checkpoint protein linking spore formation to extracellular-matrix production in Bacillus subtilis biofilms. MBio. 1, (2010).
- Lopez, D., Fischbach, M. A., Chu, F., Losick, R., Kolter, R. Structurally diverse natural products that cause potassium leakage trigger multicellularity in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 280-285 (2009).
- Lopez, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. Cannibalism enhances biofilm development in Bacillus subtilis. Mol. Microbiol. 74, 609-618 (2009).
- Arima, K., Kakinuma, A., Tamura, G. Surfactin, a crystalline peptidelipid surfactant produced by Bacillus subtilis: isolation, characterization and its inhibition of fibrin clot formation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 31, 488-494 (1968).
- Romero, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. An accessory protein required for anchoring and assembly of amyloid fibres in B. subtilis biofilms. Mol. Microbiol. 80, 1155-1168 (2011).
- Hardwood, C. R., Cutting, S. M. . Molecular Biological Methods for Bacillus. , (1990).
- Novick, R. P. Genetic systems in staphylococci. Methods Enzymol. 204, 587-636 (1991).
- Yasbin, R. E., Young, F. E. Transduction in Bacillus subtilis by bacteriophage SPP1. J. Virol. 14, 1343-1348 (1974).
- Branda, S. S., Gonzalez-Pastor, J. E., Ben-Yehuda, S., Losick, R., Kolter, R. Fruiting body formation by Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11621-11626 (2001).
- Nakano, M. M. srfA is an operon required for surfactin production, competence development, and efficient sporulation in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 173, 1770-1778 (1991).
- Gonzalez-Pastor, J. E., Hobbs, E. C., Losick, R. Cannibalism by sporulating bacteria. Science. 301, 510-513 (2003).
- Aguilar, C., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. Thinking about Bacillus subtilis as a multicellular organism. Curr. Opin. Microbiol. 10, 638-643 (2007).
- Shapiro, J. A. Thinking about bacterial populations as multicellular organisms. Annu. Rev. Microbiol. 52, 81-104 (1998).
