Одноклеточный анализ Сенная Bacillus Биопленки с помощью флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии
Summary
Микробные биопленки, как правило, составляет от различных субпопуляций специализированных клеток. Одноклеточный анализ этих подгрупп требует использования флуоресцентных журналистам. Здесь мы опишем протокол визуализировать и контролировать несколько subpopulationswithin<em> В. Сенная</em> Биопленок с помощью флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии.
Abstract
Биопленки общий атрибут почти всех бактерий 1-6. Когда бактерии образуют биопленки, клетки заключены в внеклеточный матрикс, который в основном составляют от белков и экзополисахариды, среди прочих факторов 7-10. Микробного сообщества заключенная в биопленки часто показывает дифференциацию различных субпопуляций специализированных клеток 11-17. Эти субпопуляции сосуществовать и часто показывают пространственную и временную организацию внутри биопленки 18-21.
Биопленки в модели Сенная организма Bacillus требует дифференциации различных субпопуляций специализированных клеток. Среди них, субпопуляции матрицы производители, ответственные производить и выделять внеклеточного матрикса биопленки имеет важное значение для формирования биопленок 11,19. Таким образом, дифференциация матрица производителей является отличительной чертой биопленки в B. Сенная.
Мы использовали флуоресцентные журналистам визуализировать и количественно субпопуляции матрица производителей биопленки Б. Сенная 15,19,22-24. Конкретно, мы заметили, что субпопуляции матрица производителей отличается в связи с наличием собственного производства внеклеточного сигнала surfactin 25. Интересно, что surfactin производится субпопуляции специализированные клетки отличается от субпопуляции производителей матрицы 15.
Мы подробно в докладе технического подхода необходимо визуализировать и количественно субпопуляции матрица производителей и surfactin производителей в биопленки В. зиЫШз. Для этого, флуоресцентные журналистам генов, необходимых для производства матриц и surfactin производства вставляются в хромосомы B. Сенная. Репортеры выражаются только в субпопуляции специализированных клеток. Тогда, может быть субпопуляцииконтролируется с помощью флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии (см. рис 1).
Тот факт, что различные субпопуляции специализированных клеток многоклеточного сосуществовать в пределах сообщества бактерий дает нам различные точки зрения о регуляции экспрессии генов у прокариот. Данный протокол рассматривает этот феномен экспериментально и может быть легко адаптирована к любой другой модели работы, выяснить молекулярные механизмы, лежащие в основе фенотипических неоднородность в микробного сообщества.
Protocol
Discussion
Тот факт, что бактериальных сообществ показать субпопуляции клеток, экспрессирующих определенный набор генов, свидетельствует о сложности микробных сообществ 33,34. Этот протокол должен помочь определить, является ли выражение любого интересующего гена ограничена определенной ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансируется за счет молодых исследователей программы исследований, Центра исследований в области инфекционных болезней (ZINF) из университета Вюрцбурга. С Хуан Гарсия-Бетанкур является членом доктора Высшей школы наук о жизни (GSLS) из Университета Вюрцбурга.
Materials
| Technique | Name of the reagent | Company | Catalog number |
| MSgg composition | potassium phosphate 5mM | Roth | 6878 |
| MOPS 100mM | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| Magnesium chloride 2mM | Roth | 2189.1 | |
| Calcium chloride 700μM | Roth | A119.1 | |
| Ferric chloride 50μM | Sigma-Aldrich | 157740 | |
| Zinc chloride 1μM | Applichem | A2076 | |
| Thiamine 2μM | Sigma-Aldrich | 74625 | |
| Glycerol 0.5% | Roth | 7533 | |
| Glutamate 0.5% | Sigma-Aldrich | 49621 | |
| Tryptophan 50μg/ml | Sigma-Aldrich | T0254 | |
| Phenylalanine 50μg/ml | Sigma-Aldrich | P2126 | |
| Cell fixation | Paraformaldehyde | Roth | 0335 |
| Name of the equipment | Company | Catalog number | |
| Sonication | Cell Sonicator | Bandelin | D-1000 |
| Fluorescence Microscopy | Fluorescence Microscope | Leica | DMI6000B |
| Name of the software | Company | Catalog Number | |
| Fluorescence Microscopy | AsaF | Leica | |
| Flow cytometry | FCASDiva | BD | |
| Flow cytometry | FlowJo | Treestar |
References
- Costerton, J. W. Overview of microbial biofilms. J. Ind. Microbiol. 15, 137-140 (1995).
- Davey, M. E., O’Toole, G. A. Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64, 847-867 (2000).
- Kolenbrander, P. E. Oral microbial communities: biofilms, interactions, and genetic systems. Annu. Rev. Microbiol. 54, 413-437 (2000).
- O’Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. Biofilm formation as microbial development. Annu. Rev. Microbiol. 54, 49-79 (2000).
- Donlan, R. M. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerg. Infect. Dis. 8, 881-890 (2002).
- Lopez, D., Vlamakis, H., Kolter, R. Biofilms. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, a000398-a000398 (2010).
- Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. Biofilms: the matrix revisited. Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).
- Branda, S. S., Chu, F., Kearns, D. B., Losick, R., Kolter, R. A major protein component of the Bacillus subtilis biofilm matrix. Mol. Microbiol. 59, 1229-1238 (2006).
- Latasa, C., Solano, C., Penades, J. R., Lasa, I. Biofilm-associated proteins. C. R. Biol. 329, 849-857 (2006).
- O’Gara, J. P. ica and beyond: biofilm mechanisms and regulation in Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus aureus. FEMS Microbiol Lett. 270, 179-188 (2007).
- Chai, Y., Chu, F., Kolter, R., Losick, R. Bistability and biofilm formation in Bacillus subtilis. Mol. Microbiol. 67, 254-263 (2008).
- Chen, R., Guttenplan, S. B., Blair, K. M., Kearns, D. B. Role of the sigmaD-dependent autolysins in Bacillus subtilis population heterogeneity. J. Bacteriol. 191, 5775-5784 (2009).
- Guttenplan, S. B., Blair, K. M., Kearns, D. B. The EpsE flagellar clutch is bifunctional and synergizes with EPS biosynthesis to promote Bacillus subtilis biofilm formation. PLoS Genet. 6, e1001243-e1001243 (2010).
- Kearns, D. B., Losick, R. Cell population heterogeneity during growth of Bacillus subtilis. Genes Dev. 19, 3083-3094 (2005).
- Lopez, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. Paracrine signaling in a bacterium. Genes Dev. 23, 1631-1638 (2009).
- Veening, J. W., Smits, W. K., Hamoen, L. W., Jongbloed, J. D., Kuipers, O. P. Visualization of differential gene expression by improved cyan fluorescent protein and yellow fluorescent protein production in Bacillus subtilis. Appl. Environ. Microbiol. 70, 6809-6815 (2004).
- Veening, J. W., Smits, W. K., Hamoen, L. W., Kuipers, O. P. Single cell analysis of gene expression patterns of competence development and initiation of sporulation in Bacillus subtilis grown on chemically defined media. J. Appl. Microbiol. 101, 531-541 (2006).
- Veening, J. W., Kuipers, O. P., Brul, S., Hellingwerf, K. J., Kort, R. Effects of phosphorelay perturbations on architecture, sporulation, and spore resistance in biofilms of Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 188, 3099-3109 (2006).
- Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. Control of cell fate by the formation of an architecturally complex bacterial community. Genes Dev. 22, 945-953 (2008).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nat. Rev. Microbiol. 6, 199-210 (2008).
- Veening, J. W., Smits, W. K., Kuipers, O. P. Bistability, epigenetics, and bet-hedging in bacteria. Annu. Rev. Microbiol. 62, 193-210 (2008).
- Aguilar, C., Vlamakis, H., Guzman, A., Losick, R., Kolter, R. KinD is a checkpoint protein linking spore formation to extracellular-matrix production in Bacillus subtilis biofilms. MBio. 1, (2010).
- Lopez, D., Fischbach, M. A., Chu, F., Losick, R., Kolter, R. Structurally diverse natural products that cause potassium leakage trigger multicellularity in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 280-285 (2009).
- Lopez, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. Cannibalism enhances biofilm development in Bacillus subtilis. Mol. Microbiol. 74, 609-618 (2009).
- Arima, K., Kakinuma, A., Tamura, G. Surfactin, a crystalline peptidelipid surfactant produced by Bacillus subtilis: isolation, characterization and its inhibition of fibrin clot formation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 31, 488-494 (1968).
- Romero, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. An accessory protein required for anchoring and assembly of amyloid fibres in B. subtilis biofilms. Mol. Microbiol. 80, 1155-1168 (2011).
- Hardwood, C. R., Cutting, S. M. . Molecular Biological Methods for Bacillus. , (1990).
- Novick, R. P. Genetic systems in staphylococci. Methods Enzymol. 204, 587-636 (1991).
- Yasbin, R. E., Young, F. E. Transduction in Bacillus subtilis by bacteriophage SPP1. J. Virol. 14, 1343-1348 (1974).
- Branda, S. S., Gonzalez-Pastor, J. E., Ben-Yehuda, S., Losick, R., Kolter, R. Fruiting body formation by Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11621-11626 (2001).
- Nakano, M. M. srfA is an operon required for surfactin production, competence development, and efficient sporulation in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 173, 1770-1778 (1991).
- Gonzalez-Pastor, J. E., Hobbs, E. C., Losick, R. Cannibalism by sporulating bacteria. Science. 301, 510-513 (2003).
- Aguilar, C., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. Thinking about Bacillus subtilis as a multicellular organism. Curr. Opin. Microbiol. 10, 638-643 (2007).
- Shapiro, J. A. Thinking about bacterial populations as multicellular organisms. Annu. Rev. Microbiol. 52, 81-104 (1998).
