דיסקציה של Utricle עכבר מבוגר adenovirus בתיווך זיהום המשנה תאים
Summary
תאים שיער Mechanosensory הם תאים הקולטן של האוזן הפנימית. ביותר המאופיין<em> במבחנה</em> מערכת מודל של בוגרים לתאי שיער יונקים מנצל תרבויות איברים של utricles מעכברים בוגרים. אנו מציגים דיסקציה של utricle עכבר מבוגר, ואנחנו מראים adenovirus בתיווך זיהום לתמוך תאים בתרבית utricles.
Abstract
אובדן שמיעה והפרעות מאזן נגרמות בדרך כלל עקב מותם של תאים שיער mechanosensory, שהם תאים הקולטן של האוזן הפנימית. מכיוון שאין קו התא באופן משביע רצון מייצג תאים שיער יונקים, מחקר על תאים שיער מסתמך על תרבויות איברים ראשוניים. ביותר המאופיין במערכת מודל במבחנה של בוגרים לתאי שיער יונקים מנצל תרבויות איברים של utricles מעכברים בוגרים (איור 1) 1-6. Utricle הוא איבר שיווי המשקל, ואת בתאי השיער של utricle דומים במבנה והן בתפקוד לתאי שיער באיבר השמיעה, האיבר של קורטי. עכבר מבוגר הכנה utricle מהווה האפיתל חושית בוגרת לימודי של אותות מולקולריים המווסתים את הישרדות, הומאוסטזיס, ומוות של תאים אלה.
יונקים תאים שיער שבלול הם מובחנים סופני ואינם מחדש כאשר הם הולכים לאיבוד. שאינם לאמאחוליות malian, שמיעה או מוות שיווי המשקל תא השיער מלווה התחדשות חזקים אשר משחזר השמיעה ושיווי המשקל פונקציות 7, 8. התא התחדשות שיער מתווך על ידי גליה דמויי תאים תומכים, אשר קשר עם משטחים basolateral של תאים שיער ב האפיתל חושי 9, 10. תאים תומכים גם הם מתווכים חשובים של הישרדות שיער התא ומוות 11. פיתחנו לאחרונה טכניקה זיהום לתמוך תאים בתרבית באמצעות utricles adenovirus. באמצעות סוג adenovirus 5 (dE1/E3) כדי לספק transgene המכיל GFP בשליטת היזם CMV, אנו מוצאים כי adenovirus במיוחד וביעילות מדביק תאים תומכים. תמיכה דלקת יעילות התא הוא כ 25-50%, ותאי השיער לא נגועים (איור 2). חשוב לציין, אנו מוצאים כי זיהום adenoviral לתמוך תאים לא לגרום רעילות לתאי השיער או תאים תומכים, כמו ספירת תאים ב Ad-GFP infutricles ected שקולים לאלה שאינם נגועים utricles (איור 3). כך adenovirus בתיווך ביטוי גנים בתמיכה של תאים בתרבית utricles מספק כלי רב עוצמה כדי לחקור את התפקידים של תאים תומכים כמתווכים של הישרדות שיער התא, מוות והתחדשות.
Protocol
Discussion
תאים שיער חושי רגישים המוות שנגרמו על ידי מגוון רחב של לחצים, כולל הזדקנות, טראומה רעש, חשיפה לתרופות ototoxic, כולל אנטיביוטיקה aminoglycoside ו ציספלטין סוכן antineoplastic. אצל יונקים תאים שיער תוצאות המוות אובדן שמיעה קבוע ו / או הפרעות שיווי משקל. במערכות מודל במבחנה הם כ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המחלקה למחקר המיפוי של המכון הלאומי לחירשות והפרעות תקשורת אחרות. תמיכה נוספת ניתן על ידי NIDCD 5R01 DC007613.
Materials
| Reagent | Company | Catalog number |
| Medium 199 | Gibco/Invitrogen | 12350 |
| DMEM/F12 | Gibco/Invitrogen | 11320 |
| Fine forceps (#55) | Fine Science Tools | 11255-20 |
| Fine forceps (#5) | Fine Science Tools | 11252-30 |
| Forceps (#3) | Fine Science Tools | 11231-30 |
| Penicillin G | Sigma | P3032 |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10082-139 |
| Nunc mini-tray | Fisher | 12-565-68 |
| Adenovirus-GFP | Vector Biolabs | 1060* |
| Cal-Ex decalcifier | Fisher | CS510-1D |
| sodium borohydride | Sigma | 452882 |
| Anti-Myosin 7a (polyclonal) | Proteus Biosciences | 25-6790 |
| Anti-Myosin 7a (monoclonal) | Developmental Studies Hybridoma Bank | MYO7A 138-1 |
| Anti-Calmodulin | Sigma | C 3545 |
| Anti-Calbindin | Chemicon | AB1778 |
| Fluoromount G | Southern Biotechnology Associates | 0100-01 |
Table 1. Reagents and tools used in utricle culture and adenovirus infection.
* Note: Ad-GFP is normally provided by Vector Biolabs at a stock titer of 1×1010 PFU/ml. We requested a custom amplification in order to provide the stock virus at a titer of 1.2×1011 PFU/ml.
References
- Cunningham, L. L. The adult mouse utricle as an in vitro preparation for studies of ototoxic-drug-induced sensory hair cell death. Brain Res. , (2006).
- Schmitt, N. C., Rubel, E. W., Nathanson, N. M. Cisplatin-induced hair cell death requires STAT1 and is attenuated by epigallocatechin gallate. J. Neurosci. 29, 3843-3851 (2009).
- Ou, H. C. Identification of FDA-approved drugs and bioactives that protect hair cells in the zebrafish (Danio rerio) lateral line and mouse (Mus musculus) utricle. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 10, 191-203 (2009).
- Chiu, L. L. Using the zebrafish lateral line to screen for ototoxicity. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 9, 178-190 (2008).
- Sugahara, K., Rubel, E. W., Cunningham, L. L. JNK signaling in neomycin-induced vestibular hair cell death. Hear Res. , 221-221 (2006).
- Matsui, J. I., Cotanche, D. A. Sensory hair cell death and regeneration: two halves of the same equation. Curr. Opin. Otolaryngol. Head Neck Surg. 12, 418-4125 (2004).
- Ryals, B. M., Rubel, E. W. Hair cell regeneration after acoustic trauma in adult Coturnix quail. Science. 240, 1774-176 (1988).
- Corwin, J. T., Cotanche, D. A. Regeneration of sensory hair cells after acoustic trauma. Science. 240, 1772-174 (1988).
- Shang, J. Supporting cell division is not required for regeneration of auditory hair cells after ototoxic injury in vitro. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 11, 203-222 (2010).
- Stone, J. S., Cotanche, D. A. Hair cell regeneration in the avian auditory epithelium. Int. J. Dev. Biol. 51, 6-7 (2007).
- Lahne, M., Gale, J. E. Damage-induced activation of ERK1/2 in cochlear supporting cells is a hair cell death-promoting signal that depends on extracellular ATP and calcium. J. Neurosci. 28, 4918-4928 (2008).
- Cunningham, L. L., Cheng, A. G., Rubel, E. W. Caspase Activation in Hair Cells of the Mouse Utricle Exposed to Neomycin. Journal of Neuroscience. 22, 8532-8540 (2002).
- Matsui, J. I. Caspase inhibitors promote vestibular hair cell survival and function after aminoglycoside treatment in vivo. J. Neurosci. 23, 6111-6122 (2003).
- Matsui, J. I., Ogilvie, J. M., Warchol, M. E. Inhibition of caspases prevents ototoxic and ongoing hair cell death. J. Neurosci. 22, 1218-1227 (2002).
- Nakagawa, T. A novel technique for inducing local inner ear damage. Hear Res. 176, 1-2 (2003).
- Forge, A., Li, L. Apoptotic death of hair cells in mammalian vestibular sensory epithelia. Hear Res. 139, 1-2 (2000).
- Liu, W. Caspase inhibitors prevent cisplatin-induced apoptosis of auditory sensory cells. Neuroreport. 9, 2609-2614 (1998).
- Taleb, M. Hsp70 inhibits aminoglycoside-induced hearing loss and cochlear hair cell death. Cell Stress Chaperones. 14, 427-437 (2009).
- Taleb, M. Hsp70 inhibits aminoglycoside-induced hair cell death and is necessary for the protective effect of heat shock. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 9, 277-289 (2008).
- Francis, S. P. Celastrol Inhibits Aminoglycoside-Induced Ototoxicity via Heat Shock Protein 32 (HSP32). Cell Death and Disease. , (2011).
- Wang, J. Caspase inhibitors, but not c-Jun NH2-terminal kinase inhibitor treatment, prevent cisplatin-induced hearing loss. Cancer Res. 64, 9217-9224 (2004).
- Bird, J. E. Supporting cells eliminate dying sensory hair cells to maintain epithelial integrity in the avian inner ear. J. Neurosci. 30, 12545-12556 (2010).
- Sato, E. Expression of fractalkine receptor CX3CR1 on cochlear macrophages influences survival of hair cells following ototoxic injury. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 11, 223-234 (2010).
