تشريح Utricle الفأر الكبار واتش بوساطة العدوى الداعم الخلية
Summary
خلايا الشعر Mechanosensory هي الخلايا المستقبلة في الأذن الداخلية. وأفضل وصف<em> في المختبر</em> نظام نموذج ناضج خلايا الشعر الثدييات ويستخدم الجهاز من الثقافات utricles من فئران بالغة. نقدم تشريح utricle فأر بالغ، وعلينا أن نبرهن اتش بوساطة العدوى من الخلايا في دعم utricles مثقف.
Abstract
وغالبا ما تسبب فقدان السمع واضطرابات التوازن عن طريق موت خلايا الشعر mechanosensory، والتي هي الخلايا المستقبلة في الأذن الداخلية. اذ لا يوجد اي خط الخلية التي تمثل مرض خلايا الشعر الثدييات، والبحث عن خلايا الشعر يعتمد على الثقافات الجهاز الرئيسي. وأفضل في نظام يتسم نموذج المختبر من خلايا ناضجة شعر الثدييات ويستخدم الجهاز من الثقافات utricles من الفئران (الشكل 1) 1-6. وutricle هي جهاز الدهليزي، وخلايا الشعر من utricle مماثلة في كل من التركيب والوظيفة للخلايا الشعر في الجهاز السمعي، وجهاز كورتي. وutricle الماوس إعداد الكبار يمثل ظهارة حسية للدراسات ناضجة من الاشارات الجزيئية التي تنظم بقاء على قيد الحياة، التوازن، وموت هذه الخلايا.
متباينة عضال الثدييات خلايا الشعر قوقعة وليس مجدد عندما ضائعون. في الثدييات غيرويتبع الفقاريات مالي، أو السمعي الدهليزي موت الخلايا الشعر عن طريق تجديد قوي الذي يعيد السمع والتوازن وظائف 7 و 8. وتوسطت الشعر تجديد الخلايا الدبقية التي تشبه الخلايا الداعمة، الذي اتصل السطوح basolateral من خلايا الشعر في ظهارة حسية 9 و 10. خلايا دعم تتجلى أيضا من بقاء الخلية الشعر والموت 11. وقد وضعنا مؤخرا تقنية لإصابة في دعم الخلايا في utricles مثقف باستخدام اتش. باستخدام نوع اتش 5 (dE1/E3) لتقديم التحوير التي تحتوي على GFP تحت سيطرة المروج CMV، نجد أن اتش على وجه التحديد ويصيب الخلايا بكفاءة دعم. خلية دعم كفاءة إصابة ما يقرب من 25-50٪، وعدم إصابة خلايا الشعر (الشكل 2). الأهم من ذلك، نجد أن عدوى الفيروسة الغدانية دعم الخلايا لا ينتج سمية للخلايا الشعر أو الخلايا الداعمة، وعدد الخلايا في AD-GFP INFutricles ected مكافئة لتلك التي في غير المصابة utricles (الشكل 3). وبالتالي اتش بوساطة التعبير الجيني في دعم خلايا utricles مثقف يوفر أداة قوية لدراسة دور كل من دعم خلايا وسطاء من بقاء الخلية الشعر، والموت، والتجدد.
Protocol
Discussion
خلايا الشعر الحسية هي عرضة للموت بسبب مجموعة متنوعة من الضغوط، بما في ذلك الشيخوخة، والصدمات النفسية الضوضاء، والتعرض للالعقاقير السامة، بما في ذلك المضادات الحيوية أمينوغليكوزيد وسيسبلاتين وكيل موانع الأورام. النتائج في الثدييات شعر موت الخلايا في فقدان السمع ال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل شعبة البحوث ضمن الجدران في المعهد القومي للصمم واضطرابات التواصل الأخرى. وقدم دعم إضافي من قبل 5R01 NIDCD DC007613.
Materials
| Reagent | Company | Catalog number |
| Medium 199 | Gibco/Invitrogen | 12350 |
| DMEM/F12 | Gibco/Invitrogen | 11320 |
| Fine forceps (#55) | Fine Science Tools | 11255-20 |
| Fine forceps (#5) | Fine Science Tools | 11252-30 |
| Forceps (#3) | Fine Science Tools | 11231-30 |
| Penicillin G | Sigma | P3032 |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10082-139 |
| Nunc mini-tray | Fisher | 12-565-68 |
| Adenovirus-GFP | Vector Biolabs | 1060* |
| Cal-Ex decalcifier | Fisher | CS510-1D |
| sodium borohydride | Sigma | 452882 |
| Anti-Myosin 7a (polyclonal) | Proteus Biosciences | 25-6790 |
| Anti-Myosin 7a (monoclonal) | Developmental Studies Hybridoma Bank | MYO7A 138-1 |
| Anti-Calmodulin | Sigma | C 3545 |
| Anti-Calbindin | Chemicon | AB1778 |
| Fluoromount G | Southern Biotechnology Associates | 0100-01 |
Table 1. Reagents and tools used in utricle culture and adenovirus infection.
* Note: Ad-GFP is normally provided by Vector Biolabs at a stock titer of 1×1010 PFU/ml. We requested a custom amplification in order to provide the stock virus at a titer of 1.2×1011 PFU/ml.
References
- Cunningham, L. L. The adult mouse utricle as an in vitro preparation for studies of ototoxic-drug-induced sensory hair cell death. Brain Res. , (2006).
- Schmitt, N. C., Rubel, E. W., Nathanson, N. M. Cisplatin-induced hair cell death requires STAT1 and is attenuated by epigallocatechin gallate. J. Neurosci. 29, 3843-3851 (2009).
- Ou, H. C. Identification of FDA-approved drugs and bioactives that protect hair cells in the zebrafish (Danio rerio) lateral line and mouse (Mus musculus) utricle. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 10, 191-203 (2009).
- Chiu, L. L. Using the zebrafish lateral line to screen for ototoxicity. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 9, 178-190 (2008).
- Sugahara, K., Rubel, E. W., Cunningham, L. L. JNK signaling in neomycin-induced vestibular hair cell death. Hear Res. , 221-221 (2006).
- Matsui, J. I., Cotanche, D. A. Sensory hair cell death and regeneration: two halves of the same equation. Curr. Opin. Otolaryngol. Head Neck Surg. 12, 418-4125 (2004).
- Ryals, B. M., Rubel, E. W. Hair cell regeneration after acoustic trauma in adult Coturnix quail. Science. 240, 1774-176 (1988).
- Corwin, J. T., Cotanche, D. A. Regeneration of sensory hair cells after acoustic trauma. Science. 240, 1772-174 (1988).
- Shang, J. Supporting cell division is not required for regeneration of auditory hair cells after ototoxic injury in vitro. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 11, 203-222 (2010).
- Stone, J. S., Cotanche, D. A. Hair cell regeneration in the avian auditory epithelium. Int. J. Dev. Biol. 51, 6-7 (2007).
- Lahne, M., Gale, J. E. Damage-induced activation of ERK1/2 in cochlear supporting cells is a hair cell death-promoting signal that depends on extracellular ATP and calcium. J. Neurosci. 28, 4918-4928 (2008).
- Cunningham, L. L., Cheng, A. G., Rubel, E. W. Caspase Activation in Hair Cells of the Mouse Utricle Exposed to Neomycin. Journal of Neuroscience. 22, 8532-8540 (2002).
- Matsui, J. I. Caspase inhibitors promote vestibular hair cell survival and function after aminoglycoside treatment in vivo. J. Neurosci. 23, 6111-6122 (2003).
- Matsui, J. I., Ogilvie, J. M., Warchol, M. E. Inhibition of caspases prevents ototoxic and ongoing hair cell death. J. Neurosci. 22, 1218-1227 (2002).
- Nakagawa, T. A novel technique for inducing local inner ear damage. Hear Res. 176, 1-2 (2003).
- Forge, A., Li, L. Apoptotic death of hair cells in mammalian vestibular sensory epithelia. Hear Res. 139, 1-2 (2000).
- Liu, W. Caspase inhibitors prevent cisplatin-induced apoptosis of auditory sensory cells. Neuroreport. 9, 2609-2614 (1998).
- Taleb, M. Hsp70 inhibits aminoglycoside-induced hearing loss and cochlear hair cell death. Cell Stress Chaperones. 14, 427-437 (2009).
- Taleb, M. Hsp70 inhibits aminoglycoside-induced hair cell death and is necessary for the protective effect of heat shock. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 9, 277-289 (2008).
- Francis, S. P. Celastrol Inhibits Aminoglycoside-Induced Ototoxicity via Heat Shock Protein 32 (HSP32). Cell Death and Disease. , (2011).
- Wang, J. Caspase inhibitors, but not c-Jun NH2-terminal kinase inhibitor treatment, prevent cisplatin-induced hearing loss. Cancer Res. 64, 9217-9224 (2004).
- Bird, J. E. Supporting cells eliminate dying sensory hair cells to maintain epithelial integrity in the avian inner ear. J. Neurosci. 30, 12545-12556 (2010).
- Sato, E. Expression of fractalkine receptor CX3CR1 on cochlear macrophages influences survival of hair cells following ototoxic injury. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 11, 223-234 (2010).
