Dissezione di utricolo topo adulto e adenovirus-mediata non protagonista infezione delle cellule
Summary
Cellule ciliate Mechanosensory sono le cellule recettori dell'orecchio interno. Il più caratterizzato<em> In vitro</emModello di sistema> di mature cellule ciliate mammiferi utilizza colture d'organo di otricoli da topi adulti. Presentiamo la dissezione del otricolo topo adulto, e dimostriamo adenovirus-mediata infezione di cellule di sostegno in otricoli coltura.
Abstract
La perdita dell'udito e disturbi dell'equilibrio sono spesso causati dalla morte delle cellule ciliate mechanosensory, che sono le cellule recettori dell'orecchio interno. Poiché non vi è alcuna linea cellulare che rappresenta in modo soddisfacente le cellule ciliate dei mammiferi, la ricerca sulle cellule dei capelli si basa su colture primarie di organi. Il più caratterizzato modello in vitro di cellule mature per capelli mammifero utilizza colture organo di otricoli da topi adulti (figura 1) 1-6. L'utricolo è un organo vestibolare, e le cellule ciliate del utricolo sono simili nella struttura e funzione delle cellule ciliate dell'organo uditivo, l'organo del Corti. Il mouse gli adulti, utricolo rappresenta un epitelio sensoriale matura per lo studio dei segnali molecolari che regolano la sopravvivenza, l'omeostasi, e la morte di queste cellule.
Mammiferi cellule ciliate cocleari sono terminalmente differenziate e non vengono rigenerati quando vengono persi. In non-mamvertebrati del Mali, uditivi o vestibolare morte delle cellule dei capelli è seguita dalla rigenerazione robusto che ripristina le funzioni dell'udito e dell'equilibrio 7, 8. Rigenerazione delle cellule dei capelli è mediata da cellule gliali, come le cellule di supporto, che contattano le superfici basolaterale delle cellule ciliate nell'epitelio sensoriale 9, 10. Cellule di sostegno sono anche importanti mediatori di sopravvivenza delle cellule dei capelli e la morte 11. Abbiamo recentemente sviluppato una tecnica per infezione di cellule di sostegno in otricoli coltura con adenovirus. Utilizzo di adenovirus di tipo 5 (dE1/E3) per fornire un transgene contenente GFP sotto il controllo del promotore CMV, troviamo che adenovirus specificamente e infetta efficacemente le cellule di supporto. Sostenere infezione efficienza della cella è di circa 25-50%, e le cellule dei capelli non sono infettati (figura 2). Importante, troviamo che l'infezione adenovirale di cellule di sostegno non comporta la tossicità per le cellule ciliate o cellule di supporto, come il conteggio delle cellule in Ad-GFP infette otricoli sono equivalenti a quelle non infette otricoli (Figura 3). Così adenovirus-mediata espressione genica in cellule di sostegno di otricoli coltivate fornisce un potente strumento per studiare i ruoli di cellule di sostegno come mediatori di sopravvivenza delle cellule dei capelli, la morte e rigenerazione.
Protocol
Discussion
Cellule sensoriali sono suscettibili di morte causata da una varietà di stress, compreso l'invecchiamento, trauma rumore, e l'esposizione a farmaci ototossici, compresi gli aminoglicosidi e l'agente antineoplastico cisplatino. Nei risultati di cellule di mammiferi di morte per capelli in perdita permanente dell'udito e / o disturbi dell'equilibrio. In sistemi modello in vitro sono strumenti fondamentali per gli studi volti a determinare i meccanismi cellulari e molecolari alla base…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Divisione di Ricerca intramurale presso il National Institute on Deafness e altri disturbi della comunicazione. Ulteriore supporto è stato fornito da dell'NIDCD 5R01 DC007613.
Materials
| Reagent | Company | Catalog number |
| Medium 199 | Gibco/Invitrogen | 12350 |
| DMEM/F12 | Gibco/Invitrogen | 11320 |
| Fine forceps (#55) | Fine Science Tools | 11255-20 |
| Fine forceps (#5) | Fine Science Tools | 11252-30 |
| Forceps (#3) | Fine Science Tools | 11231-30 |
| Penicillin G | Sigma | P3032 |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10082-139 |
| Nunc mini-tray | Fisher | 12-565-68 |
| Adenovirus-GFP | Vector Biolabs | 1060* |
| Cal-Ex decalcifier | Fisher | CS510-1D |
| sodium borohydride | Sigma | 452882 |
| Anti-Myosin 7a (polyclonal) | Proteus Biosciences | 25-6790 |
| Anti-Myosin 7a (monoclonal) | Developmental Studies Hybridoma Bank | MYO7A 138-1 |
| Anti-Calmodulin | Sigma | C 3545 |
| Anti-Calbindin | Chemicon | AB1778 |
| Fluoromount G | Southern Biotechnology Associates | 0100-01 |
Table 1. Reagents and tools used in utricle culture and adenovirus infection.
* Note: Ad-GFP is normally provided by Vector Biolabs at a stock titer of 1×1010 PFU/ml. We requested a custom amplification in order to provide the stock virus at a titer of 1.2×1011 PFU/ml.
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