Yetişkin Zebra balığı Myokard İnfarktüsü İndüksiyon Cryoinjury kullanma

1. Ekipman Set-up Cryoinjury gerçekleştirmek için kullanılan temel araç kriyoprob, paslanmaz çelik (Şekil 1A) yapılmış kalem gibi bir araçtır. Silindirik bir kol 40 mm uzunluğunda ve 8 mm arasında bir çapa sahiptir. Aplikatör ucu 6 mm uzunluğunda ve çapı 0,8 mm'dir. Ucu ve kol arasında bileşke uzun 4 mm koni şeklindedir. Buna ek olarak, kriyoprob bir tutamak prosedürü sırasında aracı tutarken bir parmak donmaya önlemek için, bir plastik tüp ve bant ile izole edilmesi gerekir. Kriyoterapi için gerekli diğer malzemeler stereomikroskopta, keskin forseps, mikro kesme yay makas ve bir plastik transferi pipet bulunmaktadır. Ayrıca balık transferi için balık ve bir plastik kaşık anestezi için bir ölçek hazırlar. Ameliyat sırasında, balık onun ventral yüzü yukarı (Şekil 1B) ile nemli bir sünger yerleştirilir. Bir, istikrarlı bir prosedür içinde hayvan tutunUygun oluk elle sünger yardımıyla kesilmelidir. Ameliyat sonrası balık transfer sistemi su ile bir tank hazırlayın. 10 saniyelik geri sayım ve sonra otomatik olarak 24 saniyelik geri sayım ile ilk çift zamanlayıcı kurun. 2. Cryoinjury Prosedürü En az 3 dakika boyunca sıvı azot, 3-5 cm ucu daldırarak kriyoprob soğumaya. Balık sırtını açar ve solungaçları neredeyse (yaklaşık 90 saniye) hareket durdurana kadar% 0,02 tricaine içinde immerging bir yetişkin zebrabalıkları uyutmak. (Şekil 1B) baş aşağı bir balık tutmak için kesilmiştir nemli bir sünger bir plastik kaşık ile balık aktarın. Baskın olmayan elle forseps ile sürekli balık tutun. Görme kalbin posterior medial marjı bulmak ve delinme cilde düz iridektomi makas kullanın. (Şekil 1C). Cu tarafından kalp üzerinde küçük (yaklaşık 2 mm) kesi yapmakcilt, kaslar (Şekil 1D) ile düz öne tting. Bu hayvan öldürecek gibi, kemikli brankiyal aparatı sayesinde kesmeyin. Yavaşça yenerek ventriküle doğrudan erişim için makas ucuyla hipodermis gümüş epitel tabakası (Şekil 1E) gözyaşı. Bu irade ponksiyon kalp gibi vücut boşluğunda derin makas takmayın. Atan kalpte iyi görünür olmalı ve hiçbir aşırı kanamalı torakotomi (Şekil 1F) sırasında meydana gelmelidir. 24 saniye ardından 10 saniye için belirlenen programlı zamanlayıcı başlayın. 10 saniye boyunca sıvı nitrojen gelen kriyoprob çıkarın. Hafifçe sallayarak kriyoprob üzerinde daha fazla azot olduğundan emin olun. Yanal göğüs (Şekil 1F) açmak için forseps kullanarak kesi yayıldı. Zamanlayıcı halkalar 10 saniye sonra, pr ucu ile hemen fakat nazikçe ventrikül dokunmayıne-soğutmalı kriyoprob (Şekil 1G). Zamanlayıcı halkalar 24 saniye sonra, doku kriyoprob serbest bırakmak için göğüs üzerine plastik bir pipet kullanarak sistem su 2-3 ml dökün ve sistem su tankına balık transferi. Balık birkaç saniye sonra solunum yeniden başlatmanız gerekir ve daha sonra yüzme devam etmesi gerekir. Bu yaklaşık 45 saniye sonra nefes değilse, kendi başına nefes başlayana kadar plastik bir pipetle solungaçları içine su squirting tarafından hayvan uyarırlar. Deneyimlerimize göre, balık% 95 cerrahi hayatta ve tüm ölümlerin ameliyat günü ortaya çıkar. Bu kesiler kapatılması için gerekli olmayacaktır. 3. Kalp Toplama ve Fiksasyon Kalp, iki forseps, mikro kesme makasları ve nemli oluklu sünger sabitlemek için bir mikrosantrifüj tüp formalin 2% 1 mL hazırlayın. Cryoinjury sonra, seçilen gün, 5 dakika boyunca% 0.1 'in tricaine balık euthanize. Yerleştirinkadar nemli, oluklu sünger içine balık ventral tarafta. Mikro diseksiyon makas ile brankiyal kıkırdak ile kalp üzerinde büyük bir (yaklaşık 4 mm) kesi olun. Forseps (Şekil 1H) ile yaygın kesi açın. Bulbus arteriosus, ventrikül (Şekil 1 HI) anterior beyaz bir yapı çimdiklemek ve çekerek boşluğundan kalp çıkarın. Bir bütün parçalanmış kalp Şekil 1J ve Şekil 2A 'de gösterilmiştir. % 2 formalin 1 ml ile mikrosantrifüj tüpüne 3 kupa kadar yerleştirin. Yavaşça tüp birkaç kez çevirin ve 4 bir gecede tutmak ° C 4. Kalp Montaj 5 dakika süreyle PBS içinde kalp çalkalayın. 4 ° C'de ön soğutulması gerekir% 30 sukroz 10 ml içine kalpler aktarın ve hafifçe karıştırın. Numune, başlangıçta sukroz çözeltinin yüzeyinde yüzen gerekir. 4 ° C'de 1 saat 20 dakika süreyle inkübe Devam SonraBu süre, kalpleri tüpün dibine batar. Kuru buz ile bir kutu hazırlayın. Bir gömme kalıp alın ve kalıbın altındaki Ekim montaj orta bir 5 mm tabaka dökülür. Forseps kalıp orta montaj OC T içine yerleştirin kalp ile. Stereomikroskop altında, üste doğru kalıp altındaki ventriküler apeks ve bulbus arteriosus ulaşmak için numunenin yönünü ayarlamak. Kuru buz ile numune kalıpları yerleştirin. Montaj orta dondurmak başladığında, Ekim orta ile kalıp geri kalanı doldurmak ve tamamen donmasına izin. Kesit daha önce -80 ° C sıcaklıkta, en az 1 saat boyunca kalıp tutmak. Donmuş örnek -80 birçok ay boyunca saklanabilir ° C 5.. Kesit Kalpler 16 um arasında bir kesme boyutu, -24 ° C arasında bir sıcaklıkta haznesi ve -22 ° C'de numunelerin sıcaklığı ile bir kriyostat ayarlama Ile dondurulmuş blok yerleştirinkriyostat olarak örnek ve blok alt paralel kesme başlamak için yönünü düzeltmek. Bir blok başına altı SuperFrost-artı slaytlar hazırlamak ve 1 ila 6 bunları numaralamak. Doku ulaşılana kadar kesme başlatın ve bir traş bıçağı ile numune etrafında blok kırpın. 6 elde etmek için bir kalp çoğaltır, slayt 1 ilk bölümünde, slayt 2 ikinci bölümünde, slayt 3 üçüncü sürebilir, vb sonra slayt 6 Altıncı bölümde yer, slayt 1 ile yeniden başlatın ve kadar devam Tüm organ kesilir. Slayt üzerinde yaklaşık 8 bölümden iki satır (Şekil 3) toplayın. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca izin slaytlar kuru. -20 ° C'de ağzı sıkıca kapalı kutularda 1 yıl kadar için saklayın 6. Temsilcisi Sonuçlar Bu protokolü takip Temsilcisi kardiyak yaralanma 4 dpci az disseke bütün kalpleri gösterilir (gün sonrası cryoinjury; Şekil 2D-F). V içinin vivo miyokardiyal doku isualize, kardiyak spesifik cmlc-2 promotör 11,12 kontrolü altında EGFP ve nükleer DsRed2 ifade transjenik balık kullanılır. EGFP ve DsRed2 floresan sinyallerin yokluğu apikal-lateral ventrikül duvar boyunca bir disk şeklinde infarkt bölgesi sınırları belirgin. Dokusunun hücresel ve moleküler analizleri gerçekleştirmek için, kalpleri sabit ve bir kriyostat ile kesitler alındı. Transversal kalp bölümleri ardışık ile temsili bir kayar Şekil 3 'de gösterilmiştir. Bölümleri çeşitli yöntemler (Şekil 4) ile analiz edilebilir. Skar kalbe karşı rejenerasyon kapsamını belirlemek için, farklı şekilde kardiyak ve fibrotik dokuların 9 etiketler Asit Fuchsin Turuncu-G (AFOG) boyama kullanarak histolojik analizi yapıldı. Gen ekspresyon analizleri situ hibridizasyon prosedürü göre elde edildi <sup> 13. Işaretleyici proteinlerin dağılımını saptamak için, spesifik antikorlar 9 kullanılarak, bağışıklık testi uygulamıştır. Çeşitli boyama işlemleri bir arada kardiyak rejenerasyon aşağıdaki cryoinjury yer moleküler ve hücresel mekanizmaların tanımlanmasına yol açar. Şekil 1. Yetişkin zebrabalıkları içinde ventrikül cryoinjury indüklenmesi. Kriyoprob (A) bir fotoğraf. (B) yetişkin zebrabalıkları kadar olan ventral yüzü sünger yarık yerleştirilir. Kalp erişmek için (CF) Göğüs kesi. (C) deri ve kas yoluyla küçük bir kesik iki göğüs yüzgeçlerinin (kırmızı çizgi) arasında yapılır. (D) makas kırmızı ok takip deri kesmek için kesi eklenir. (E) deri altında, gümüş hipodermis ince bir tabaka (mavi kesikli çizgi ile çevrili) yavaşça kalp erişmek için açılır. (F) kesi ile yayılırforseps ve dayak ventrikül (yeşil ok) cryoinjury için erişilebilir. (G) soğuk kriyoprob yavaşça kalp dokunmak için göğüs içine yerleştirilir. (HJ) Kalp koleksiyonu. (H) Bir derin ve uzun kesi perikard boşluğu erişmek için göğüs brankiyal kemerleri ile yapılır. İki kalp yapıları görülebilir: bulbus arteriosus (beyaz ok) ve ventrikül (yeşil ok). (I) bulbus arteriosus forseps ile tutun ve vücut boşluğundan dışarı çekilir. (J) tamamı kalp gövdesinin den kesilip çıkarılan edilir. Şekil 2. Temsilcisi kontrolü ve EGFP ve kardiyomiyositlerde nükleer DsRed2 ifade yetişkin transgenik zebrabalıkları diseke cryoinjured kalpler. (AC) kalp yaralanmamış. (A) karanlık alan aydınlatma ventrikül gösterir atriyuma ventriküle bağlantılı olduğu (V), bulbus arteriosus (Ba, beyaz) ve vanalar (Va). T (B ve C) Floresan görüntüleri O sağlam ventrikül ekran EGFP ve kardiyomiyositlerde DsRed2 ifade. 4 gün sonrası cryoinjury at (DF) Kalp (4 dpci) (D) karanlık alan aydınlatma bir disk şeklinde infarkt (sarı kesikli çizgi) açığa çıkarır. (EF) kardiyomiyosit işaretleri EGFP ve DsRed2 hasarlı miyokard (kesikli çizgi ile çevrili) gösteren, infarkt alanında algılanmaz. Şekil 3. Kalp Kesit. Kalp üst kısmına doğru kalp (1 ve 2, kırmızı) (yeşil 3 ve 4) alt başlayarak enine bölüm çizime ile (A) Tam kalp. (B) AFOG (Asit Fuchsin Turuncu-G) ile boyanarak ardışık kesitler serisi ile bir slayt fotoğrafçılığı. Birinci bölüm (1 ve 2, beyaz kareler) ventriküler Apex içerir, ve kalp (3 ve 4, yeşil kareler) ile son bölümler bulbusu arteriozus içermektedir. iles/ftp_upload/3666/3666fig4.jpg "/> Analizi Şekil 4. Örnekler 7 gün sonrası cryoinjury az kalp bölümlerde gerçekleştirilir. Turuncu (A) AFOG (Asit Fuchsin Turuncu-G) boyama etiketler sağlıklı kas hücreleri, kırmızı, mavi ve fibrin içinde kollajen içeren skar dokusu. (B) ventriküler miyozin ağır zincir (vmhc) in situ hibridizasyon olarak mRNA sağlam miyokard (mavi boyama) görüntüler. Yaralı dokuya kardiyak gen transkript (kırmızı kesikli çizgi) yoksundur. (C) tropomiyozin ve Immunoassaying (yeşil) sağlam kardiyomiyositler değil, hasarlı doku (kesikli çizgi ile çevrili) etiketler. DAPI (mavi) lekeler tüm hücrelerin çekirdekleri. (D) çekirdeklerinde Genetik etiketli kardiyomiyositler ekspres DsRed2 (kırmızı). DAPI (mavi) tüm çekirdeklerin etiketler. Enfarkt bölgesi DsRed2-pozitif hücrelerin (beyaz kesikli çizgi) içermez.