Inductie van myocardinfarct bij Adult Zebravissen Met behulp van Cryoinjury
Summary
De zebravis is een waardevol model om de mechanismen van het hart regeneratie studeren in gewervelde dieren. Hier presenteren we een protocol voor inductie van een hartinfarct bij volwassen zebravissen met cryoinjury. Deze methode resulteert in een massale celdood binnen 20% van de ventriculaire wand, vergelijkbaar met dat in zoogdiercellen infarcten.
Abstract
De zoogdieren hart is niet in staat om belangrijke regeneratie na een acute blessure zoals myocardinfarct 1. Daarentegen urodele amfibieën en beenvissen behouden van een opmerkelijk vermogen voor cardiale regeneratie met weinig of geen littekens gedurende het hele leven 2,3. Het is niet bekend waarom alleen sommige niet-zoogdieren gewervelde dieren kan een volledig orgaan opnieuw uit de restanten van weefsels 4,5. Om de moleculaire en cellulaire verschillen tussen de regeneratieve reacties in verschillende soorten te begrijpen, moeten we een soortgelijke aanpak te gebruiken voor het induceren van acute blessures.
Bij zoogdieren is het meest gebruikte model om cardiale reparatie studeren geweest acute ischemie na een ligatie van de kransslagader of weefsel vernietiging na cryoinjury 6,7. De cardiale regeneratie in de salamanders en de zebravis is voornamelijk onderzocht na een gedeeltelijke resectie van de ventriculaire apex 2,3. Onlangs zijn enkele groepen establRouveroy laat de cryoinjury techniek bij volwassen zebravissen 8-10. Deze methode biedt grote mogelijkheden omdat hierdoor een vergelijkende bespreking van de resultaten van het zoogdier niet-zoogdiersoorten.
Hier presenteren we een methode om een reproduceerbare schijfvormige infarct van de zebravis ventrikel door cryoinjury induceren. Deze verwonding model is gebaseerd op snel invriezen-ontdooien weefsel, waardoor grote celdood van ongeveer 20% van cardiomyocyten van de ventriculaire wand. Eerst werd een kleine incisie gemaakt door de borst met iridectomie een schaar naar het hart te openen. De ventriculaire wand rechtstreeks bevroren door toepassing van 23-25 seconden een roestvrijstalen cryoprobe voorgekoeld in vloeibare stikstof. Om de bevriezing van het hart, vis water op kamertemperatuur te stoppen werd gedropt op het puntje van de cryoprobe. De procedure wordt goed verdragen door dieren, met een overlevingskans van 95%.
Om het herstel proces te karakteriseren, de harten warenverzameld en gefixeerd op verschillende dagen na cryoinjury. Vervolgens werden het monster ingesloten voor cryosectioning. De dia met secties werden verwerkt voor histologisch onderzoek, in situ hybridisatie en immunofluorescentie. Deze verbintenis vergroot ons begrip van de factoren die nodig zijn voor de regeneratieve plasticiteit in de zebravis, en bieden nieuwe inzichten in de machinerie van cardiale regeneratie. Een conceptueel en moleculaire begrip van hart-en regeneratie in de zebravis zal gevolgen hebben voor de ontwikkelingsbiologie en regeneratieve geneeskunde.
Protocol
Discussion
Cryoinjury wordt gedefinieerd als de gecontroleerde beschadiging van weefsel door de nauwkeurige toepassing van extreem lage 14. Direct thermische schok vernietigt de cellen door eiwitten vernietiging en door de intracellulaire vloeistof ijskristal formatie die het plasmamembraan breuken. Bijgevolg is de gewonde cellen sterven in het proces van apoptose en necrose 14. Beide celdood mechanismen aangetoond tot weefselverlies dragen na een hartinfarct 15. Zo cryoinjury is een geschikt model voor het induceren van een hartinfarct. Verschillende studies dit goed bewezen methode in verschillende zoogdieren, waaronder muizen, ratten, konijnen en varkens 6,7. De aanpassing van de cryoinjury protocol in de zebravis kan een meer vergelijkende discussie over het infarct reactie tussen verschillende soorten.
Twee andere groepen onafhankelijk van elkaar ontwikkeld cryoinjury procedure voor de volwassen zebravissen hart. De belangrijkste verschillen zijn de surGery methoden, het type gereedschap en toegepast vriestijd. In de studie van González-Rosa et al.., Werd het hartzakje geopend door het scheuren van het weefsel in plaats van te snijden. Ze gebruikten 0,3 mm koperen draad verbonden met een polyamide buis vooraf gekoeld in vloeibare stikstof om het hart voor enkele seconden bevriezen totdat het ontdooien kan 10 worden waargenomen. In de studie door Schnabel et al.. Een conische stuk droogijs van 20 mm lengte met de punt van 2 mm in de diameter werd gebruikt om de kern raken 10 seconden 8. De twee groepen kregen, ventriculaire schade door dood van het myocard. Het voordeel van onze methode is een meer reproduceerbaar afzetting van collageen-rijke litteken, die beter nabootst het begin van de infarct healing responses waargenomen bij zoogdieren systemen.
De kritische stap tijdens de cryoinjury procedure in de zebravis is het maken van een incisie door de huid en de hartzak zonder aanprikken van de onderliggende hart. Een correct de presenced operatie zorgt ervoor dat kleine bloedingen. Hevige bloedingen geeft een onbedoelde punctie van het ventrikel met de schaar. In dergelijke gevallen moet de dieren worden teruggetrokken uit het experiment. Om te beschadigen het hart, moet de punt van de schaar gericht onder een kleine hoek met de huid.
Een ander belangrijk aspect voor het maken van een reproduceerbare schade is de exacte positie van de koude cryoprobe de ventrikel voor optimale exacte duur. Te kort invriezen tijd zal resulteren in een ontsteking met weinig celdood. Langdurige bevriezing, anderzijds, kan grote beschadigingen van het hart, hetgeen kan leiden tot een verhoogde mortaliteit van de dieren. We hebben vastgesteld dat de optimale tijd om de ventrikel houden in bevroren toestand varieert 23-26 seconden voor een 2 cm lang volwassenen zebravis en kan afhankelijke verschillen van de grootte van de dieren.
Omdat onze protocol zeer eenvoudig en snel zijn er geen experimentele limieteidingen te onderwerpen voldoende aantal dieren voldoende biologische replicatie te verkrijgen. De cryochirurgie behandeling zeer goed verdragen wordt door de dieren. Collection van het hart op verschillende tijdstippen na cryoinjury kan gedetailleerde karakterisering van de volgende fasen tijdens het regeneratieproces. De experimentele analyse van de cryoinjured harten kunnen bestaan uit 1) visualisatie van gentranscriptie door in situ hybridisatie, 2) detectie van eiwit distributie door immunofluorescentie kleuring, 3) histologische beeldvorming van verschillende structuren. Het begrijpen van de belangrijkste genezingsproces na een myocardinfarct in de zebravis zal invloed hebben op het gebied van regeneratieve biologie. Bovendien kan het nuttig zijn voor het ontwerpen van nieuwe therapeutische benaderingen in de regeneratieve geneeskunde.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken V. Zimmermann voor een uitstekende technische bijstand en voor vissen zorg. Dit werk werd ondersteund door de Zwitserse National Science Foundation, licentienummer: 310000_120611.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Micro dissecting spring scissors | Roboz Surgical Instrument Co., Inc. | RS-5602 |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 |
| Formaldehyde ~36% | Sigma-Aldrich | 47630 |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100 |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura Finetek | 4583 |
| Slides Superfrost Plus | Fisher Scientific | 12-550-15 |
| Peel-A-Way Disposable Embedding Molds – Truncated Molds T8 | Polyscience, Inc. | 18985 |
References
- Laflamme, M. A., Murry, C. E. Heart regeneration. Nature. 473, 326-335 (2011).
- Singh, B. N., Koyano-Nakagawa, N., Garry, J. P., Weaver, C. V. Heart of newt: a recipe for regeneration. J. Cardiovasc. Transl. Res. 3, 397-409 (2010).
- Poss, K. D. Getting to the heart of regeneration in zebrafish. Semin. Cell Dev. Biol. 18, 36-45 (2007).
- Ausoni, S., Sartore, S. From fish to amphibians to mammals: in search of novel strategies to optimize cardiac regeneration. J. Cell Biol. 184, 357-364 (2009).
- Borchardt, T., Braun, T. Cardiovascular regeneration in non-mammalian model systems: what are the differences between newts and man. Thrombosis and haemostasis. 98, 311-318 (2007).
- Bos, E. J. v. a. n. d. e. n., Mees, B. M., de Waard, M. C., de Crom, R., Duncker, D. J. A novel model of cryoinjury-induced myocardial infarction in the mouse: a comparison with coronary artery ligation. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 289, H1291-H1300 (2005).
- van Amerongen, M. J., Harmsen, M. C., Petersen, A. H., Popa, E. R., van Luyn, M. J. Cryoinjury: a model of myocardial regeneration. Cardiovasc. Pathol. 17, 23-31 (2008).
- Schnabel, K., Wu, C. C., Kurth, T., Weidinger, G. Regeneration of cryoinjury induced necrotic heart lesions in zebrafish is associated with epicardial activation and cardiomyocyte proliferation. PLoS ONE. 6, (2011).
- Chablais, F., Veit, J., Rainer, G., Jazwinska, A. The zebrafish heart regenerates after cryoinjury-induced myocardial infarction. BMC Dev. Biol. 11, 21 (2011).
- González-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138, 1663-1674 (2011).
- Rottbauer, W. Reptin and pontin antagonistically regulate heart growth in zebrafish embryos. Cell. 111, 661-672 (2002).
- Burns, C. G. High-throughput assay for small molecules that modulate zebrafish embryonic heart rate. Nature chemical biology. 1, 263-264 (2005).
- Chablais, F., Jazwinska, A. IGF signaling between blastema and wound epidermis is required for fin regeneration. Development. 137, 871-879 (2010).
- Baust, J. G., Gage, A. A. The molecular basis of cryosurgery. BJU Int. 95, 1187-1191 (2005).
- Whelan, R. S., Kaplinskiy, V., Kitsis, R. N. Cell death in the pathogenesis of heart disease: mechanisms and significance. Annual review of physiology. 72, 19-44 (2010).
