الاستقراء من احتشاء عضلة القلب في الزرد الكبار باستخدام Cryoinjury
Summary
الزرد يمثل نموذجا قيما لدراسة آليات تجديد القلب في الفقاريات. هنا، نقدم بروتوكول للتحريض من احتشاء القلب في الزرد الكبار باستخدام cryoinjury. هذا الأسلوب يؤدي إلى موت الخلايا هائل في غضون 20٪ من جدار البطين، مماثلة لتلك التي لوحظت في عوائق الثدييات.
Abstract
قلب الثدييات غير قادرة على تجديد كبير اثر اصابة الحادة مثل احتشاء عضلة القلب 1. على النقيض من ذلك، urodele البرمائيات والأسماك مكتملة العظام الاحتفاظ قدرة فائقة على التجدد القلب مع القليل أو لا تندب طوال حياته 2،3. ومن غير المعروف لماذا فقط بعض الفقاريات غير الثدييات يمكن إعادة جهاز كامل من بقايا أنسجة 4،5. فهم الفروق الجزيئي والخلوي بين استجابات التجدد في مختلف الأنواع، ونحن في حاجة إلى استخدام نهج مماثل لإحداث الإصابات الحادة.
في الثدييات، لقد كان النموذج الأكثر استخداما لدراسة إصلاح القلب نقص تروية حاد بعد عملية ربط الشريان التاجي أو تدمير الأنسجة بعد cryoinjury 6،7. وقد تم تجديد القلب في سمندل الماء والزرد درس في الغالب بعد استئصال جزئي للقمة البطين 2،3. في الآونة الأخيرة، عدة مجموعات لديها أنشأناished تقنية cryoinjury في 8-10 الزرد الكبار. هذا الأسلوب لديها امكانات كبيرة لأنه يسمح للمناقشة النسبية للنتائج التي تم الحصول عليها من أنواع الثدييات وغير الثدييات.
هنا، نقدم طريقة للحث على استنساخه على شكل قرص احتشاء البطين الزرد بواسطة cryoinjury. ويستند هذا النموذج على إصابة الأنسجة تجميد لاذابة سريع، مما يؤدي الى موت الخلايا هائلة من حوالي 20٪ من العضلية للجدار البطين. أولا، قدم من خلال شق صغير في الصدر مع مقص قطع القزحية للوصول إلى القلب. تم تجميده مباشرة جدار البطين من قبل التقدم بطلب للحصول 23-25 ثوان مسبار بالبرد الفولاذ المقاوم للصدأ precooled في النيتروجين السائل. لوقف تجميد أسماك المياه القلب، في درجة حرارة الغرفة والتي ألقيت على غيض من مسبار بالبرد. لأنه يتحمل جيدا الإجراء من قبل الحيوانات، مع معدل البقاء على قيد الحياة من 95٪.
لوصف عملية التجدد، وكانت قلوبجمعها وثابتة في أيام مختلفة بعد cryoinjury. بعد ذلك، كانت جزءا لا يتجزأ من العينة لcryosectioning. تم تجهيز الشرائح مع أقسام للتحليل النسيجي، في التهجين الموضع والمناعي. هذا المشروع يعزز فهمنا للعوامل التي مطلوبة من أجل اللدونة التجدد في الزرد، وتقديم رؤى جديدة في آلية تجديد القلب. وهناك فهم المفاهيم والجزيئي للتجديد في قلب الزرد تؤثر على حد سواء البيولوجيا التطورية والطب التجديدي.
Protocol
Discussion
كما يتم تعريف Cryoinjury الضرر للرقابة من الأنسجة من تطبيق دقيق من 14 البرد القارس. الصدمة الحرارية مباشرة يدمر الخلايا عن طريق تدمير البروتين والسوائل داخل الخلايا بواسطة الجليد تشكيل الكريستال التي تتمزق غشاء البلازما. وبالتالي، فإن خلايا المصابين يموتون في عمليات موت الخلايا المبرمج ونخر 14. وقد تبين أن كلا من هذه الآليات إلى موت الخلايا تساهم في فقدان الأنسجة بعد احتشاء عضلة القلب 15. وبالتالي، cryoinjury يمثل نموذج مناسب من الأمر الذي أدى إلى احتشاء القلب. وذكرت العديد من الدراسات أثبتت هذه الطريقة بشكل جيد في مختلف الثدييات، بما في ذلك الفئران والارانب والفئران والخنازير 6،7. والتكيف التابع لبروتوكول cryoinjury في الزرد تمكن مناقشة أكثر مقارنة عن استجابة احتشاء بين الأنواع المختلفة.
مجموعتين أخريين تطويرها بشكل مستقل الإجراء cryoinjury للقلب الزرد الكبار. الاختلافات الرئيسية هي سورطرق جيري، ونوع من الأدوات والوقت تجميد تطبيق. في هذه الدراسة من قبل وآخرون غونزاليس روزا.، افتتح تأمور بواسطة تمزيق النسيج بدلا من القطع. تستخدم خيوط النحاس 0،3 مم ربط أنبوب polyamid مسبقا تبرد في النتروجين السائل لتجميد قلب لبضع ثوان حتى يمكن ملاحظة ذوبان 10. في الدراسة التي استخدمت شنابل وآخرون، وقطعة من الثلج الجاف مخروطي الشكل بطول 20 ملم مع طرف مدبب من 2 مليمتر في القطر لتلمس القلب لمدة 10 ثانية 8. المجموعتين التي تم الحصول عليها من خلال الضرر البطيني موت عضلة القلب. في الاستفادة من طريقة لدينا هو ترسب أكثر استنساخه من ندبة-الكولاجين الغنية، والذي يحاكي أفضل للشفاء في وقت مبكر احتشاء الردود التي لوحظت في نظم الثدييات.
في خطوة حاسمة أثناء إجراء cryoinjury في الزرد يتم إجراء شق طريق الجلد وكيس التامور بدون ثقب في القلب الكامنة. وperforme بشكل صحيحد جراحة يسبب النزيف قليلا. نزيف غزير يدل على وجود ثقب غير مقصود من البطين مع مقص. في مثل هذه الحالات، ينبغي أن تراجع هذه الحيوانات من التجربة. من أجل تجنب ثقب في القلب، ينبغي أن تستهدف نقطة من مقص بزاوية حادة للجلد.
وهناك جانب آخر مهم لخلق اصابة استنساخه هو تحديد المواقع الدقيقة للمسبار بالبرد الباردة في البطين لمدة دقيقة الأمثل. ووقت التجميد قصيرة جدا تؤدي إلى التهاب مع موت الخلايا القليل. تجميد لفترة طويلة، من ناحية أخرى، قد تتسبب في أضرار واسعة النطاق للقلب، مما قد يؤدي إلى وفيات المعزز للحيوانات. عقدنا العزم على أن الوقت الأمثل لعقد البطين في نطاقات دولة المجمدة بين 23-26 ثانية لالزرد 2 سم الكبار طويلة، وانها قد تختلف بشكل تابع لحجم الحيوانات.
لأن لدينا بروتوكول بسيط جدا وسريع، ليست هناك حدود التجريبيةations في إخضاع عدد كاف من الحيوانات للحصول على مكررات البيولوجية كافية. هو جيد جدا لعلاج cryosurgical التسامح من قبل الحيوانات. جمع قلوب في نقاط زمنية مختلفة بعد cryoinjury يسمح توصيف مفصل للمراحل اللاحقة أثناء عملية التجدد. يجوز للتحليل التجريبي للقلوب cryoinjured تشمل 1) تصور من النسخ الجيني بواسطة التهجين في الموقع، 2) الكشف عن التوزيع بواسطة بروتين مناعي تلطيخ، 3) التصوير النسيجي للهياكل مختلفة. وفهم عمليات الشفاء مفتاح بعد احتشاء عضلة القلب في الزرد تؤثر في مجال البيولوجيا التجدد. وعلاوة على ذلك، قد يكون من المفيد لتصميم مناهج علاجية جديدة في الطب التجديدي.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر خامسا زيمرمان للحصول على مساعدة فنية ممتازة ورعاية الأسماك. وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية، منحة رقم: 310000_120611.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Micro dissecting spring scissors | Roboz Surgical Instrument Co., Inc. | RS-5602 |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 |
| Formaldehyde ~36% | Sigma-Aldrich | 47630 |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100 |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura Finetek | 4583 |
| Slides Superfrost Plus | Fisher Scientific | 12-550-15 |
| Peel-A-Way Disposable Embedding Molds – Truncated Molds T8 | Polyscience, Inc. | 18985 |
References
- Laflamme, M. A., Murry, C. E. Heart regeneration. Nature. 473, 326-335 (2011).
- Singh, B. N., Koyano-Nakagawa, N., Garry, J. P., Weaver, C. V. Heart of newt: a recipe for regeneration. J. Cardiovasc. Transl. Res. 3, 397-409 (2010).
- Poss, K. D. Getting to the heart of regeneration in zebrafish. Semin. Cell Dev. Biol. 18, 36-45 (2007).
- Ausoni, S., Sartore, S. From fish to amphibians to mammals: in search of novel strategies to optimize cardiac regeneration. J. Cell Biol. 184, 357-364 (2009).
- Borchardt, T., Braun, T. Cardiovascular regeneration in non-mammalian model systems: what are the differences between newts and man. Thrombosis and haemostasis. 98, 311-318 (2007).
- Bos, E. J. v. a. n. d. e. n., Mees, B. M., de Waard, M. C., de Crom, R., Duncker, D. J. A novel model of cryoinjury-induced myocardial infarction in the mouse: a comparison with coronary artery ligation. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 289, H1291-H1300 (2005).
- van Amerongen, M. J., Harmsen, M. C., Petersen, A. H., Popa, E. R., van Luyn, M. J. Cryoinjury: a model of myocardial regeneration. Cardiovasc. Pathol. 17, 23-31 (2008).
- Schnabel, K., Wu, C. C., Kurth, T., Weidinger, G. Regeneration of cryoinjury induced necrotic heart lesions in zebrafish is associated with epicardial activation and cardiomyocyte proliferation. PLoS ONE. 6, (2011).
- Chablais, F., Veit, J., Rainer, G., Jazwinska, A. The zebrafish heart regenerates after cryoinjury-induced myocardial infarction. BMC Dev. Biol. 11, 21 (2011).
- González-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138, 1663-1674 (2011).
- Rottbauer, W. Reptin and pontin antagonistically regulate heart growth in zebrafish embryos. Cell. 111, 661-672 (2002).
- Burns, C. G. High-throughput assay for small molecules that modulate zebrafish embryonic heart rate. Nature chemical biology. 1, 263-264 (2005).
- Chablais, F., Jazwinska, A. IGF signaling between blastema and wound epidermis is required for fin regeneration. Development. 137, 871-879 (2010).
- Baust, J. G., Gage, A. A. The molecular basis of cryosurgery. BJU Int. 95, 1187-1191 (2005).
- Whelan, R. S., Kaplinskiy, V., Kitsis, R. N. Cell death in the pathogenesis of heart disease: mechanisms and significance. Annual review of physiology. 72, 19-44 (2010).
