Induktion eines Myokardinfarktes in Adult Zebrafisch Mit Cryoinjury
Summary
Zebrafisch stellt ein wertvolles Modell, um die Mechanismen von Herz-Regeneration bei Wirbeltieren zu untersuchen. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Induktion eines Herzinfarktes bei erwachsenen Zebrafisch mit cryoinjury. Dieses Verfahren führt zu einer massiven Zelltod innerhalb von 20% der Ventrikelwand, ähnlich der in Säugetieren Infarkten beobachtet.
Abstract
Das Säugetier-Herzens in der Lage ist signifikante Regeneration nach einer akuten Verletzung wie Myokardinfarkt 1. Im Gegensatz dazu behalten urodele Amphibien und Knochenfische eine bemerkenswerte Fähigkeit zur kardialen Regeneration mit wenig oder ohne Narbenbildung während des gesamten Lebens 2,3. Es ist nicht bekannt, warum nur einige Nicht-Säugetier-Wirbeltiere können eine komplette Orgel aus dem Rest Gewebe 4,5 neu zu erstellen. Um die molekularen und zellulären Unterschiede zwischen regenerativen Reaktionen in verschiedenen Spezies zu verstehen, müssen wir ähnliche Ansätze zur Induktion von akuten Verletzungen verwenden.
Bei Säugetieren ist das am häufigsten verwendete Modell zur Herzwiederherstellung Studie akute Ischämie nach einer Ligatur der Koronararterie oder Zerstörung von Gewebe nach cryoinjury 6,7. Die kardialen Regeneration im Zebrafisch Molche und wurde überwiegend nach einer Teilresektion des ventrikulären Apex 2,3 untersucht. In jüngster Zeit haben mehrere Gruppen establIshed die cryoinjury Technik bei erwachsenen Zebrafisch 10.08. Diese Methode hat ein großes Potenzial, weil es eine vergleichende Diskussion der Ergebnisse aus den Säugetier-und Nicht-Säugetier-Spezies erhalten werden können.
Hier präsentieren wir eine Methode, um eine reproduzierbare scheibenförmigen Infarkt des Zebrafisch Ventrikels durch cryoinjury induzieren. Diese Verletzung Modell basiert auf schnelle Gefrier-Tau-Gewebe, das in massiver Zelltod von etwa 20% der Kardiomyozyten der Ventrikelwand Ergebnissen. Zuerst wurde ein kleiner Einschnitt in die Brust mit Iridektomie Scheren, um die Herzen zu übersetzen. Die Ventrikelwand wurde direkt durch die Anwendung für 23-25 Sekunden ein Edelstahl Kryosonde in flüssigem Stickstoff eingefroren vorgekühlt. Um das Einfrieren des Herzens, der Fisch Wasser bei Raumtemperatur zu stoppen war an der Spitze der Kryosonde gesunken. Das Verfahren wird auch von den Tieren vertragen, mit einer Überlebensrate von 95%.
Um den Regenerationsprozess zu charakterisieren, wurden die Herzengesammelt und an verschiedenen Tagen nach cryoinjury befestigt. Anschließend wurden die Proben für Kryoschneiden eingebettet. Die Folien mit Schnitte wurden für die histologische Analyse verarbeitet werden, in-situ-Hybridisierung und Immunfluoreszenz. Das Unternehmen erweitert unser Verständnis der Faktoren, die für die regenerative Plastizität im Zebrafisch benötigt werden, und liefern neue Einblicke in die Maschinerie der kardialen Regeneration. Ein konzeptionelles Verständnis der molekularen und Herz Regeneration im Zebrafisch wird Auswirkungen sowohl der Entwicklungsbiologie und der regenerativen Medizin.
Protocol
Discussion
Cryoinjury wird als kontrollierte Beschädigung des Gewebes durch die präzise Anwendung extremer Kälte 14 definiert. Direkt thermischen Schock zerstört die Zellen durch Proteine zu zerstören und intrazellulärer Flüssigkeit die Bildung von Eiskristallen, die die Plasmamembran zerreißt. Als Folge sterben die verletzten Zellen in den Verfahren der Apoptose und Nekrose 14. Beide Zelltodmechanismen Es ist gezeigt worden, um Gewebe Verlust nach Myokardinfarkt 15 beitragen. Somit stellt cryoinjury ein geeignetes Modell zur Induktion einer Herzinfarkt. Mehrere Studien berichteten auch diese Methode erwies sich in verschiedenen Säugetieren, darunter Mäuse, Ratten, Kaninchen und Schweine 6,7. Die Anpassung des cryoinjury Protokoll im Zebrafisch ermöglicht eine vergleichende Diskussion über den Infarkt Reaktion zwischen verschiedenen Spezies.
Zwei weitere Gruppen, die unabhängig die cryoinjury Verfahren für die erwachsenen Zebrafisch Herz entwickelt. Die Hauptunterschiede sind die surgery Verfahren, die Art der Instrumente und angewendet Gefrierzeit. In der Studie von González-Rosa et al. Wurde der Herzbeutel durch Zerreißen des Gewebes statt Schneiden eröffnet. Sie verwendeten 0,3 mm Kupfer Filament in Verbindung mit einem Polyamid Rohr in flüssigem Stickstoff, um das Herz für einige Sekunden, bis Auftauen könnte 10 beobachtet wird, einzufrieren vorgekühlt. In der Studie von Schnabel et al., Eine konische Stück Trockeneis von 20 mm Länge mit einer spitz zulaufenden Spitze von 2 mm im Durchmesser wurde verwendet, um das Herz für 10 Sekunden 8 zu berühren. Die beiden Gruppen erhalten ventrikulären Schäden durch den Tod des Herzmuskels. Der Vorteil unserer Methode ist eine besser reproduzierbare Ablagerung von Kollagen-reiche Narbe, die besser imitiert die frühen Infarkt heilende Reaktionen in Säugetier-Systemen beobachtet.
Die entscheidender Schritt bei der cryoinjury Verfahren Zebrafisch ist ein Einschnitt durch die Haut und den Herzbeutel ohne Durchstechen der zugrunde liegenden Herzens. Ein richtig performed Chirurgie verursacht wenig Blutungen. Profuse Blutung weist auf eine unbeabsichtigte Punktion des Ventrikels mit der Schere. In solchen Fällen sollten die Tiere aus dem Experiment zurückgezogen werden. Um zu vermeiden, Punktieren des Herzens, sollte der Punkt der Schere in einem flachen Winkel auf die Haut gerichtet sein.
Ein weiterer wichtiger Aspekt für die Erstellung einer reproduzierbare Verletzung ist die genaue Positionierung des kalten Kryosonde auf den Ventrikel für die optimale genaue Dauer. Zu kurz Einfrieren Zeit wird bei der Entzündung mit wenig Zelltod führen. Längere Einfrieren, auf der anderen Seite kann erheblichen Schaden anrichten des Herzens, die eine verstärkte Mortalität der Tiere führen kann. Wir stellten fest, dass der optimale Zeitpunkt, um das Ventrikel in den gefrorenen Zustand im Bereich zwischen 23 bis 26 Sekunden lang für eine 2 cm lang erwachsenen Zebrafisch, und es kann abhängig von der Größe unterscheiden der Tiere.
Weil unser Protokoll ist sehr einfach und schnell, gibt es keinen experimentellen Grenzeations in unterwerfen ausreichende Anzahl von Tieren, um eine angemessene biologische Replikationen zu erhalten. Das kryochirurgische Behandlung wird sehr gut von den Tieren gut vertragen. Sammlung der Herzen zu verschiedenen Zeitpunkten nach cryoinjury ermöglicht detaillierte Charakterisierung der nachfolgenden Phasen während des regenerativen Prozess. Die experimentelle Analyse der cryoinjured Herzen können gehören: 1) Darstellung der Gentranskription durch in situ Hybridisierung, 2) Detektion von Protein Verteilung durch Immunfluoreszenzfärbung, 3) histologischen Bildgebung mit unterschiedlichen Strukturen. Das Verständnis der Schlüssel Heilungsprozesse nach einem Herzinfarkt im Zebrafisch wird Auswirkungen auf den Bereich der Regenerativen Biologie. Darüber hinaus könnte es von Vorteil sein für die Gestaltung neuer therapeutischer Ansätze in der regenerativen Medizin.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken V. Zimmermann für hervorragende technische Assistenz und Pflege für die Fische. 310000_120611: Diese Arbeit wurde von der Swiss National Science Foundation, Grant-Nummer unterstützt.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Micro dissecting spring scissors | Roboz Surgical Instrument Co., Inc. | RS-5602 |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 |
| Formaldehyde ~36% | Sigma-Aldrich | 47630 |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100 |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura Finetek | 4583 |
| Slides Superfrost Plus | Fisher Scientific | 12-550-15 |
| Peel-A-Way Disposable Embedding Molds – Truncated Molds T8 | Polyscience, Inc. | 18985 |
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