Için İpek Film Kültür Sistemi In vitro Analizi ve Tasarımı Biyomateryal
Summary
İpek filmler biyomedikal uygulamalar bir dizi için kolayca özelleştirilebilir biyomalzemelerin yeni bir sınıfı vardır. Sunulan ipek film kültürü sisteminin çeşitli çok iyi adapte olduğu<em> In vitro</em> Analizleri. Bu sistem bir biyomateryal tasarım platformu sunan temsil<em> In vitro</emDoğrudan çeviri önce> optimizasyonu<em> In vivo</em> Modelleri.
Abstract
İpek filmleri bir araştırma laboratuvarı ortamında 1,2 içinde yüksek sadakat ve ekonomik ile imal edilebilir protein bazlı biyomateryaller umut vericidir. Bunlar, yüksek kontrol edilebilen boyutsal ve materyal özelliklere sahip hücre adezyonu biyolojik uyumlu ve teşvik vardır, çünkü bu malzemelerin arzu edilir, topografik desen ile ya da kimyasal olarak yüzey değiştirerek modifiye edilebilir, ve ilaç verme, ilgili uygulama için biyolojik olarak etkin olan moleküller için bir depo olarak kullanılabilirler 3-8. Ayrıca, ipek filmler dakika içinde eritmek veya in vitro veya in vivo yıldır aşağılamak için tasarlanmış olabilir, özel tasarımı oldukça basit olup, doğada şeffaf ve görüntüleme uygulamaları 9 dolayısıyla çok uygun olmanın yararı ile üretmek vardır – 13. Burada sunulan kültür sistemi metodolojisi hücre ipek film yüzeyinin hızlı değerlendirmeler için ölçeklenebilir bir yaklaşımı temsiletkileşimleri. Özellikle ilgi hizalama 12,14 için hücre çoğalması ve hücrelerin yanıtları farklılıklar çalışma yüzeyine desenli ipek filmlerin kullanımıdır. Numaralı seribaşı kültürleri mikro-desenli ve düz ipek filmi yüzeylerde hem kültüre ve sonra time-lapse faz-kontrast görüntüleme, taramalı elektron mikroskobu ve metabolik aktivite ve nükleik asit içeriği biyokimyasal değerlendirmesi yoluyla değerlendirildi. Özet olarak, in vitro kültür sistemde ipek filmi daha sonra in vivo modeller optimize edilmiş ve daha sonra tercüme edilebilir bir biyomateryal substrat hücre-yüzey etkileşimleri, çalışmalarına uygun özelleştirilebilir bir deney düzeneği sunmaktadır. Burada sunulan kültür sistemi kullanılarak Gözlemler henüz temel hücre etkileşimleri, tıbbi cihaz tasarımı kadar uygulamaları yardımcı olmak için kullanılan ve böylece biyomedikal alanlarında geniş bir yelpazede alakalı edilir.
Protocol
Discussion
Hücre kültürü için bir substrat olarak rejenere ipek filmlerin kullanılması, bu proteinin malzeme özelliklerinin kapsamlı karakterizasyonu nedeniyle son yirmi yılda popülerlik kazanmış ve biyomalzeme programı 3,8 anlayışı artmıştır. Burada anlatılan kültür sistemi desenli ipek filmin biyomateryal yüzeylerde 7 hücre yüzey etkileşimlerini değerlendirmek için in vitro test sisteminde yeni bir temsil eder. Sistem kolayca yüksek verimli veri toplama için kabul edilebilir zaman içinde hücresel etkileşimlerin derinlemesine analiz sağlar. Kovalent modifikasyon veya adsorpsiyon yoluyla çeşitli yüzey kimyası, yüzey kontrolü mikro / nano-yüzey topografisi 7: ipek filmler de dahil olmak üzere doğrudan hücre fonksiyonu 8,9,12 etkileyen değiştirilebilir ayarlanabilir biyomalzeme birtakım özelliklerini, sahip, çünkü bu büyük ölçüde etkin sağlam mech; biyolojik olarak aktif moleküllerin 13anical özellikleri 15,16; malzeme hidrofiliklik / hidrofobikliğinin 16 kontrolü; sürümü 4,8,17 için biyolojik bileşiklerin toplu yükleme ve ikincil yapı kontrolü ile kontrollü çözülme / enzimatik bozunma oranları (beta sayfalık içeriği) 11,18,19 .
Ipek filmlerin asetat su buharı 7,15 varlığında vakum altında bir süre için film tavlama ile elde edilir. Bu yaklaşım, işlem ışığı 15 minimum kırınımı izin verirken suda çözünmezlik malzemenin teşvik, β-tabaka ikincil yapı oluşmasına izin verir. Filmlerin Bu şeffaflık mikroskop sistemleri 12,20 herhangi bir sayı kullanarak görüntüleme yöntemleri (örneğin geniş alan ve floresan) bir numarası altında istihdam edilebilir doğrudan canlı hücre görüntüleme sağlayan temel unsurdur. Canlı-hücre görüntüleme ek olarak, ipek filmler kolayca th çıkarılabilire kültür sistemi ilave tespit ve analiz için izin vermek. Böylece, bu sistem üzerinde gerçekleştirilebilir doğrudan deney değerlendirmelerinin çok çeşitli teknik alanda birçok 3,8,9,12,13,21 için hücre / doku kaynakları, çok çeşitli için de geçerlidir. Time-lapse görüntüleme sonuçlarını gerçek zamanlı kültür veri toplanabilir ve bir örnek yüzey topografisi hücre ilişkileri nasıl etkilediğini göstermek için kullanılmıştır olarak gösteriyoruz. Temsilcisi sonuçları ipek filmi biyomateryaller HCLE kültür büyümeyi desteklemek için kullanılabilir göstermek ve standart hücresel proliferasyonu ve metabolik testler (Şekil 4) bir dizi iyileştirilebilir vardır. Buna ek olarak, kültür sabitlenir ve elektron görüntüleme veya diğer protokolleri (Şekil 3) taranması için işlenir.
İpek Film yüzeylerde yüksek sadakat, tutarlılık ile laboratuarda üretilen ve nispeten düşük maliyetli (Şekil 1). Vardır Bu farklı sa sağlarkültür sistemi kurulumu ve deneysel sonuçlar her iki çıkarak. Bu su-tavlama işlemi çözeltisi içinde 2,15,22 proteaz konsantrasyonu bekleyen degradasyon oranı tanımlanmış bulunmaktadır kültür içinde stabil bir ipek film malzeme üretir olduğu gösterilmiştir. Sonuç olarak, bu maddeler, uzun süreli Hücre kültürü için çok uzun süre için kullanılabilir, ya da fizyolojik yerde 8 bağlı olarak ay veya yıldır implante kalır. Ayrıca, son zamanlardaki araştırmalar protein yapısı ve su-tavlanmış ipek filmlerin iki yığın malzeme özellikleri çeşitli mekanik ve biofiziksel test yöntemleri 15,16 vasıtasıyla gösterildiği gibi tekrarlanabilir kültürü sonuçlar için izin parti için tutarlı olduğunu göstermektedir. 7,23,24 SEM, atomik kuvvet micrscopy (AFM) ve hücre kültürü çalışmaları {: 2008wr, Omenetto: 2008tc, Bray 2011kq Lawrence} gösterilen Buna ek olarak, malzemenin yüzey filmi gruplar arasında büyük vefa göstermiştir. Malzeme stabilSığ ve tutarlılık hücrenin çeşitli mechanotransduction yolları aracılığıyla kültür substrat algılayan ve sonuçta istenmeyen / istenen hücresel yanıt 25,26 üretecek nasıl önemli bir faktördür.
Bu tür doku kültürü tedavi plastik veya cam gibi kültür yüzeyler için tarihsel standartlara, hücre eki için yeterli ortamlar sağlarlar. Bununla birlikte, bu malzemelerin in vivo olarak daha faydalı için iyileştirilebilir değildir. Bu bir ipek filmin biyomateryal in vitro özelleştirilmiş olabilir, ve bir kez deneysel beklentiler özelleştirilmiş filmin doğrudan vivo modelde bir tercüme edilebilir ulaşıldığını da tasavvur edilebilir. Vivo ve in vitro deneylerin arasında böyle eşleştirilmiş tasarım rutin in vitro kullanılan diğer zeminler üzerine böyle bir gömülebilir ipek biyomateryaller için büyük bir avantaj sunuyor.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH K08EY015829, R21EY019561, R24EY015656, P41 EB002520 ve Körlük Kariyer Geliştirme Ödülü, ve Tri-Kurumsal Kök Hücre Girişimi Önlemek için R01 EY020856 Araştırma fon. HCLE hücre hattı Dr Ilene Gipson nezaket sağladı. Yazarlar, hücre kültürü, SEM görüntüleme, at Doku Mühendisliği Kaynak Merkezi (TERC) ile onun teknik yardım için özel ameliyatları için Hastanesi'nde Anthony Labissiere ona teknik destek ve rehberlik için Weill Cornell Tıp Koleji'nde Dr Aihong Liu teşekkür etmek istiyorum teknik malzeme geliştirme ile destek ve silikon üretim konusunda yardım almak için nano Bilim ve Teknoloji Tesisi Cornell Merkezi (CNF) için Tufts Üniversitesi.
Materials
| Material Name | Company | Catalogue Number |
| Silk cocoons | Tajima Shoji Co., LTD. | NA |
| PDMS monomer and cross-linker | Momentive | RTV615A 01P |
| Sodium Carbonate | Sigma | S2127 |
| Lithium Bromide | Sigma | 213225 |
| Slide-A-Lyzer | Thermo Scientific | 66110 |
| 1 mL Syringe | Becton-Dickenson | 309602 |
| Stainless steel washer | Superior Washer | 81610 |
| 24-well plate | VWR | 353047 |
References
- Rockwood, D., Preda, R. C., Yucel, T., Wang, X., Lovett, M. L., Kaplan, D. L. Materials Fabrication from Bombyx mori Silk Fibroin. Nature protocols. , (2011).
- Lawrence, B., Omenetto, F., Chui, K., Kaplan, D. Processing methods to control silk fibroin film biomaterial features. Journal of materials science. 43, 6967-6985 (2008).
- Altman, G., Diaz, F., Jakuba, C., Calabro, T., Horan, R., Chen, J. Silk-based biomaterials. Biomaterials. 24, 401-416 (2003).
- Hofmann, S., Wong, P. o., Foo, C., Rossetti, F., Textor, M., Vunjak-Novakovic, G., Kaplan, D. Silk fibroin as an organic polymer for controlled drug delivery. Journal of Controlled Release. 111, 219-227 (2006).
- Demura, M., Asakura, T. Immobilization of glucose oxidase with Bombyx mori silk fibroin by only stretching treatment and its application to glucose sensor. Biotechnology and bioengineering. 33, 598-603 (1989).
- Cebe, P., Kaplan, D. Mechanism of enzymatic degradation of beta-sheet crystals. Biomaterials. , (2010).
- Lawrence, B., Cronin-Golomb, M., Georgakoudi, I., Kaplan, D., Omenetto, F. Bioactive silk protein biomaterial systems for optical devices. Biomacromolecules. 9, 1214-1220 (2008).
- Meinel, L., Hofmann, S., Karageorgiou, V., Kirker-Head, C., McCool, J., Gronowicz, G. The inflammatory responses to silk films in vitro and in vivo. Biomaterials. 26, 147-155 (2005).
- Vepari, C., Kaplan, D. Silk as a biomaterial. Progress in Polymer Science. 32, 8-9 (2007).
- Li, M., Ogiso, M., Minoura, N. Enzymatic degradation behavior of porous silk fibroin sheets. Biomaterials. 24, 357-365 (2003).
- Arai, T., Freddi, G., Innocenti, R., Tsukada, M. Biodegradation of Bombyx mori silk fibroin fibers and films. Journal of Applied Polymer Science. 91, 2383-2390 (2004).
- Lawrence, B., Marchant, J., Pindrus, M., Omenetto, F., Kaplan, D. Silk film biomaterials for cornea tissue engineering. Biomaterials. 30, 1299-1308 (2009).
- Ma, X., Cao, C., Zhu, H. The biocompatibility of silk fibroin films containing sulfonated silk fibroin. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 78, 89-96 (2006).
- Patel, A., Thakar, R., Chown, M., Ayala, P. Biophysical mechanisms of single-cell interactions with microtopographical cues. Biomedical. , (2010).
- Jin, H., Park, J., Karageorgiou, V., Kim, U., Valluzzi, R., Cebe, P. Water-Stable Silk Films with Reduced β-Sheet Content. Advanced Functional Materials. 15, 1241-1247 (2005).
- Lawrence, B., Wharram, S., Kluge, J., Leisk, G., Omenetto, F., Rosenblatt, M. Effect of Hydration on Silk Film Material Properties. Macromolecular Bioscience. 10, 393-403 (2010).
- Zhang, Y. Natural silk fibroin as a support for enzyme immobilization. Biotechnology Advances. 16, 961-971 (1998).
- Cebe, P., Kaplan, D. Mechanism of enzymatic degradation of beta-sheet crystals. Biomaterials. , (2010).
- Shaw, J. Fractionation of the fibroin of Bombyx mori with trypsin. Biochemical Journal. 93, 45 (1964).
- Rice, W., Firdous, S., Gupta, S., Hunter, M., Foo, C., Wang, Y. Non-invasive characterization of structure and morphology of silk fibroin biomaterials using non-linear microscopy. Biomaterials. 29, 2015-2024 (2008).
- Chirila, T., Barnard, Z., Harkin, D., Schwab, I., Hirst, L. Bombyx mori silk fibroin membranes as potential substrata for epithelial constructs used in the management of ocular surface disorders. Tissue Engineering Part A. 14, 1203-1211 (2008).
- Hu, X., Shmelev, K., Sun, L., Gil, E. -. S., Park, S. -. H., Cebe, P. Regulation of Silk Material Structure by Temperature-Controlled Water Vapor Annealing. Biomacromolecules. 12, 1686-1696 (2011).
- Omenetto, F., Kaplan, D. A new route for silk. Nature Photonics. 2, 641-643 (2008).
- Bray, L. J., George, K. A., Ainscough, S. L., Hutmacher, D. W., Chirila, T. V., Harkin, D. G. Human corneal epithelial equivalents constructed on Bombyx mori silk fibroin membranes. Biomaterials. 32, 5086-5091 (2011).
- Wang, N., Tytell, J. D., Ingber, D. E. Mechanotransduction at a distance: mechanically coupling the extracellular matrix with the nucleus. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 75-82 (2009).
- Jaalouk, D. E., Lammerding, J. Mechanotransduction gone awry. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 63-73 (2009).
