Seta Film per la cultura del sistema In vitro Analisi e Progettazione Biomaterial
Summary
Film di seta sono una nuova classe di biomateriali facilmente personalizzabili per una serie di applicazioni biomediche. Il sistema presentato pellicola sericoltura è altamente adattabile ad una varietà di<em> In vitro</em> Analisi. Questo sistema rappresenta un biomateriale offerta piattaforma di progettazione<em> In vitro</emOttimizzazione> prima della traduzione diretta<em> In vivo</em> Modelli.
Abstract
Pellicole seta sono promettenti biomateriali a base di proteine che possono essere fabbricate con alta fedeltà ed economico in un ambiente di 1,2 ricerche di laboratorio. Questi materiali sono desiderabili perché possiedono caratteristiche dimensionali e materiale altamente controllabile, sono biocompatibili e promuovere l'adesione cellulare, possono essere modificate attraverso patterning topografico o chimicamente alterare la superficie, e può essere utilizzato come un deposito di molecole biologicamente attive per applicazioni di consegna droga 3-8. Inoltre, i film di seta sono relativamente facili da design personalizzato, può essere progettato per sciogliere in pochi minuti o degradare anni in vitro o in vivo, e si produce con il vantaggio di essere trasparente in natura e quindi particolarmente adatto per applicazioni di imaging 9 – 13. La metodologia sistema di coltura qui presentato rappresenta un approccio scalabile per la rapida valutazione della cella-seta superficie del filminterazioni. Di particolare interesse è l'uso di pellicole superficie seta fantasia per studiare le differenze nella proliferazione cellulare e le risposte di cellule per l'allineamento 12,14. Le colture seminate sono state coltivate su entrambi i micro-fantasia e il fondo piatto substrati di film di seta, e quindi valutate attraverso time-lapse a contrasto di fase imaging, microscopia elettronica a scansione, e la valutazione biochimica di attività metabolica e contenuto di acido nucleico. In sintesi, il film seta sistema di coltura in vitro offre una configurazione sperimentale personalizzabile adatto allo studio di interazioni di superficie cellulare su un substrato biomateriale, che possono poi essere ottimizzati e poi tradotto in modelli in vivo. Osservazioni che utilizzano il sistema cultura qui presentate sono attualmente utilizzate per aiutare in applicazioni che vanno dalle interazioni cellulari di base per la progettazione di dispositivi medici, e quindi sono rilevanti per una vasta gamma di settori biomedici.
Protocol
Discussion
L'uso di pellicole di seta rigenerata come substrato per la coltura cellulare ha guadagnato in popolarità nel corso degli ultimi due decenni a causa di caratterizzazione estensiva delle proprietà del materiale di questa proteina e una maggiore comprensione della sua utilità biomateriale 3,8. Il sistema di coltura qui descritto rappresenta un nuovo sistema di test in vitro per valutare le interazioni cellulari di superficie su seta fantasia film di biomateriale substrati 7. Il sistema permette di analisi in profondità di interazioni cellulari nel tempo che può essere facilmente adottati per l'alta velocità di raccolta dati. Questo è in gran parte attivata perché i film di seta in possesso di un certo numero di sintonizzabili proprietà biomateriale che può essere modificato per incidere direttamente la funzione delle cellule 8,9,12, tra cui: il controllo della superficie micro / nano-topografia di superficie 7; chimiche superficiali diversi attraverso la modificazione covalente o adsorbimento di molecole biologicamente attive 13; robusta mechproprietà anical 15,16: controllo delle idrofilia materiale / idrofobicità 16; caricamento di massa di composti biologici per il rilascio 4,8,17, e dissoluzione controllata / tassi di degradazione enzimatica attraverso il controllo della struttura secondaria (contenuto foglietto beta) 11,18,19 .
La trasparenza dei film di seta viene raggiunto attraverso ricottura dei film per un periodo di tempo sotto vuoto in presenza di vapore acqueo 7,15. Questo approccio consente di elaborazione per la formazione di β-sheet struttura secondaria, favorendo l'insolubilità del materiale in acqua pur consentendo diffrazione minimo di luce 15. La trasparenza dei film è fondamentale per consentire la diretta live-cell imaging che può essere assunto con un certo numero di modalità di imaging (cioè wide-field e fluorescenza) con qualsiasi numero di sistemi microscopio 12,20. Oltre a live-cella di imaging, seta film può essere facilmente rimosso dal thcultura del sistema e per consentire fissaggio e analisi supplementari. Così, la grande varietà di diretti valutazioni sperimentali che possono essere eseguiti su questo sistema sono applicabili ad un'ampia varietà di cellule / tessuti fonti per molti settori tecnici 3,8,9,12,13,21. I time lapse risultati delle immagini illustrano come dati in tempo reale di coltura possono essere raccolti, e come esempio sono stati utilizzati per illustrare come la topografia delle superfici sulle interazioni cellulari. I risultati rappresentativi dimostrano come biomateriali pellicola seta può essere utilizzato per sostenere la crescita HCLE cultura, e sono modificabili a un certo numero di standard di proliferazione cellulare e saggi metabolici (Fig. 4). Inoltre, le colture sono fissati e trattati per la scansione di immagini di elettroni o altri protocolli (Fig. 3).
Substrati di film di seta sono prodotte in laboratorio con l'alta fedeltà, coerenza, e con costi relativamente bassi (Fig. 1). Ciò consente riproducibilitàlità sia configurazione cultura del sistema e dei risultati sperimentali. È stato dimostrato che l'acqua-ricottura elaborazione produce un materiale stabile seta cinematografico all'interno di coltura che ha definito velocità di degradazione in attesa della concentrazione di proteasi in soluzione 2,15,22. Come risultato di questi materiali possono essere utilizzati per lunghi periodi di tempo a lungo termine di coltura cellulare, o restare impiantato per mesi o anni a seconda della posizione fisiologica 8. Inoltre, studi recenti hanno dimostrato che sia la struttura della proteina e delle proprietà materiali di acqua ricotto film di seta sono coerenti da lotto a lotto che consente risultati della coltura riproducibili, come mostrato attraverso vari metodi di prova meccanici e biofisici 15,16. Inoltre, la superficie del materiale ha dimostrato grande fedeltà tra i lotti di film come indicato dalla SEM, micrscopy a forza atomica (AFM), e studi su colture cellulari {Lawrence: 2008wr, Omenetto: 2008tc, Bray: 2011kq} 7,23,24. Materiale stabillità e coerenza è un fattore importante per come la cellula rileverà il substrato coltura attraverso i percorsi meccanotrasduzione varie, e infine produrre un desiderato / indesiderato risposta cellulare 25,26.
Standard Storiche substrati di coltura, come la plastica di coltura di tessuti trattati o di vetro, di fornire adeguati supporti per il fissaggio delle cellule. Tuttavia, questi materiali non sono modificabili per l'ulteriore utilità in vivo. Può essere previsto che una seta cinematografico biomateriale potrebbe essere adattato in vitro, e una volta aspettative sperimentali sono stati raggiunti il film può essere personalizzato direttamente tradotto in un modello in vivo. Tale disegno accoppiamento tra in vitro e in vivo sperimentazione offre un grande vantaggio per tali biomateriali seta impiantabili oltre altri substrati che vengono abitualmente utilizzati in vitro.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il finanziamento previsto dal NIH K08EY015829, R21EY019561, R24EY015656, P41 EB002520 e R01 EY020856 ricerca per prevenire Career Development Award cecità, e Tri-Istituzionale Stem Cell Initiative. Linea cellulare HCLE per gentile concessione del Dr. Ilene Gipson. Gli autori desiderano ringraziare il Dott. Liu Aihong al Weill Cornell Medical College per la sua assistenza tecnica e di orientamento con la coltura cellulare, Anthony Labissiere presso l'Hospital for Special Ambulatori per la sua assistenza tecnica SEM imaging, il Tissue Engineering Resource Center (TERC) a Tufts University per l'assistenza tecnica con lo sviluppo materiale, Cornell e il Centro per la scienza su nanoscala e MET (CNF) per l'assistenza nella produzione di wafer di silicio.
Materials
| Material Name | Company | Catalogue Number |
| Silk cocoons | Tajima Shoji Co., LTD. | NA |
| PDMS monomer and cross-linker | Momentive | RTV615A 01P |
| Sodium Carbonate | Sigma | S2127 |
| Lithium Bromide | Sigma | 213225 |
| Slide-A-Lyzer | Thermo Scientific | 66110 |
| 1 mL Syringe | Becton-Dickenson | 309602 |
| Stainless steel washer | Superior Washer | 81610 |
| 24-well plate | VWR | 353047 |
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