סרט משי תרבות מערכת במבחנה ניתוח ביולוגי עיצוב
Summary
סרטי משי הם קבוצה חדשה של biomaterials בקלות להתאמה אישית עבור מערך של יישומים ביו. הסרט הציג משי מערכת התרבות ניתנת להתאמה ביותר למגוון של<em> במבחנה</em> ניתוחים. מערכת זו מהווה הצעת ביולוגי פלטפורמת עיצוב<em> במבחנה</em> ייעול לפני בתרגום ישיר<em> In vivo</em> מודלים.
Abstract
סרטי משי מבטיחים חלבון מבוססי biomaterials זה יכול להיות מפוברק עם נאמנות גבוהה מבחינה כלכלית בתוך 1,2 מעבדת מחקר הסביבה. חומרים אלה רצוי כי הם בעלי מאפיינים ממדי חומר לשליטה מאוד, הם ביולוגית לקדם את הידבקות התא, ניתן לשנות באמצעות דפוסים טופוגרפית או על ידי שינוי כימי של פני השטח, והוא יכול לשמש מחסן של מולקולות פעילות ביולוגית לאספקת יישומים סמים הקשורות 3-8. בנוסף, סרטי משי הם פשוט יחסית עיצוב מותאם אישית, יכול להיות מתוכנן לפרק בתוך דקות או לבזות לאורך השנים או במבחנה in vivo, והם מייצרים עם מוסף של להיות שקוף בטבע, ולכן מתאים במיוחד עבור יישומי הדמיה 9 – 13. מערכת התרבות המתודולוגיה המוצגת כאן מייצג גישה להרחבה על הערכות מהירה של שטח פני התא משי הסרטאינטראקציות. מעניינת במיוחד היא השימוש פני סרטי משי בדוגמת ללמוד הבדלי התרבות התאים ואת תגובותיהם של תאים עבור יישור 12,14. התרבויות היו בתרבית זרע בשני מיקרו בדוגמת ושטוח הסרט מצעים משי, ולאחר מכן להעריך את ההדמיה שלב בניגוד זמן לשגות, סריקה מיקרוסקופית אלקטרונים, והערכה ביוכימי של פעילות מטבולית ותוכן חומצות גרעין. לסיכום, סרט משי במערכת התרבות חוץ גופית מציעה התקנה ניסיונית להתאמה אישית מתאים ללימוד על פני קרום התא אינטראקציות על מצע ביולוגי, אז מה שיכול להיות מותאם ולאחר מכן לתרגם את במודלים vivo. תצפיות באמצעות מערכת התרבות המוצגת כאן כרגע בשימוש לסייע יישומים החל אינטראקציות סלולריים הבסיסיים לעיצוב מכשור רפואי, ולכן הם רלוונטיים למגוון רחב של תחומים ביו.
Protocol
Discussion
השימוש סרטי משי שהתחדשו כמו המצע של תרבית תאים צברה פופולריות בשני העשורים האחרונים בשל אפיון נרחב של תכונות החומר של חלבון זה והגדילה הבנה של השירות שלה ביולוגי 3,8. מערכת התרבות המתוארת כאן מהווה הרומן במערכת בדיקות במבחנה להערכת אינטראקציות פני התא על משי בדוגמת הסרט ביולוגי מצעים 7. המערכת מאפשרת ניתוח מעמיק של אינטראקציות הסלולר לאורך זמן, כי ניתן לאמץ בקלות איסוף נתונים תפוקה גבוהה. זו מתאפשרת בעיקר בגלל סרטי משי בעל מספר תכונות מתכונן ביולוגי כי ניתן לשנות באופן ישיר להשפיע על תפקוד התא 8,9,12, כולל: שליטה על פני מיקרו / ננו משטח הטופוגרפיה 7; chemistries השטח שונים באמצעות שינוי קוולנטי או ספיחה ביולוגית של מולקולות פעילות 13; הנדסת חזקיםתכונות anical 15,16; בקרה של hydrophilicity חומר / hydrophobicity 16, טוען רוב תרכובות ביולוגיות לשחרור 4,8,17 וכן פירוק מבוקר / שיעורי השפלה אנזימטיות באמצעות שליטה על המבנה המשני (תוכן גיליון בטא) 11,18,19 .
השקיפות של סרטי משי מושגת באמצעות חישול הסרטים לתקופה של זמן תחת ואקום בנוכחות אדי מים 7,15. גישה זו מאפשרת עיבוד ליצירת מבנה β גיליונות משני, טיפוח insolubility של החומר במים תוך מתן אפשרות עקיפה מינימלית של אור 15. זו השקיפות של הסרטים הוא המפתח המאפשר הדמיה ישירה בשידור חי תאים שיכולים להיות מועסקים תחת מספר שיטות הדמיה (כלומר רחב שדה הקרינה) באמצעות מספר רב של מערכות מיקרוסקופ 12,20. בנוסף הדמיה חיה תאים, סרטי משי ניתן להסיר בקלות מן התרבות מערכת הדואר, כדי לאפשר ניתוח קיבוע נוסף. לכן, מגוון רחב של הערכות ניסיוניות ישירות כי ניתן לבצע במערכת זו החלות על מגוון רחב של תאים / רקמות מקורות עבור שדות טכניים רבים 3,8,9,12,13,21. את זמן לשגות תוצאות ההדמיה להמחיש כיצד נתונים בזמן אמת תרבות ניתן לאסוף, ובתור דוגמה נוצלו כדי להמחיש עד כמה הטופוגרפיה משטח משפיע על אינטראקציות התא. התוצאות מייצגות להדגים כיצד biomaterials סרט משי יכול להיות מנוצל כדי לתמוך בצמיחה תרבות HCLE, והם amendable למספר התרבות תאים סטנדרטיים מבחני מטבולית (איור 4). בנוסף, התרבויות קבועים ומעובדים לצורך סריקה והדמיה אלקטרונים או פרוטוקולים אחרים (איור 3).
הסרט מצעים משי מיוצרים במעבדה עם איכות גבוהה, עקביות, עם עלות נמוכה יחסית (איור 1). זה מאפשר reproducibility בהגדרת התרבות גם מערכת ותוצאות הניסוי. הוכח כי מים לחשל עיבוד מייצרת משי יציבה הסרט בחומר תרבות הגדיר שיעורי השפלה ממתינים ריכוז של פרוטאזות בתמיסה 2,15,22. כתוצאה מכך חומרים אלה עשויים לשמש עבור פרקי זמן ארוכים של תרבות ארוכת טווח תאים, או להישאר מושתל במשך חודשים או שנים בהתאם למיקום הפיזיולוגי 8. בנוסף, העבודה האחרונה הראו כי הן את המבנה של חלבונים תכונות החומר של מים annealed סרטי משי עולים בקנה אחד מתוך אצווה כדי אצווה המאפשר תוצאות תרבות לשחזור כפי שמוצג באמצעות שיטות בדיקה שונות מכניים biophysical 15,16. בנוסף, פני השטח של החומר הראה נאמנות רבה בקרב קבוצות הסרט כפי שמצוין SEM, כוח אטומי micrscopy (AFM), ואת לימודי התרבות תאים {לורנס: 2008wr, Omenetto: 2008tc, בריי: 2011kq} 7,23,24. חומר stability ועקביות הוא גורם חשוב איך התא יהיה לחוש את מצע התרבות דרך מסלולים mechanotransduction שונים, ובסופו של דבר לייצר התגובה הרצויה / לא רצויה הסלולר 25,26.
סטנדרטים היסטוריים מצעים תרבות, כגון פלסטיק רקמת התרבות טיפול או זכוכית, מספקים מצעים מתאימים עבור קובץ מצורף התא. עם זאת, חומרים אלה אינם amendable עבור השירות נוספת in vivo. זה יכול להיות שחזה כי משי הסרט ביולוגי יכול להיות מותאם אישית במבחנה, ופעם הציפיות הניסוי היה להשיג את הסרט מותאם אישית יכול להיות מתורגם ישירות במודל vivo. עיצוב זיווג כזה בין במבחנה ניסויים vivo מציע יתרון גדול על אלה biomaterials משי מושתלת על מצעים אחרים המשמשים שגרתי במבחנה.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
במימון K08EY015829 NIH, R21EY019561, R24EY015656, EB002520 P41, ו R01 EY020856 מחקר למניעת עיוורון קריירה פיתוח פרס, ואת Tri-מוסדיים תא גזע היוזמה. שורת תאים HCLE סיפק באדיבות ד"ר איילין Gipson. המחברים מבקשים להודות לד"ר Aihong ליו ב-Weill Cornell Medical College לקבלת סיוע טכני והדרכה אותה עם תרבית תאים, אנתוני Labissiere בבית החולים עבור ניתוחים מיוחדים לקבלת סיוע טכני שלה SEM הדמיה, הנדסת רקמות מרכז (TERC) בשעה טאפטס לעזרה טכנית עם פיתוח חומר, והמרכז קורנל ננו מדע וטכנולוגיה מתקן (CNF) לסיוע בייצור פרוסות סיליקון.
Materials
| Material Name | Company | Catalogue Number |
| Silk cocoons | Tajima Shoji Co., LTD. | NA |
| PDMS monomer and cross-linker | Momentive | RTV615A 01P |
| Sodium Carbonate | Sigma | S2127 |
| Lithium Bromide | Sigma | 213225 |
| Slide-A-Lyzer | Thermo Scientific | 66110 |
| 1 mL Syringe | Becton-Dickenson | 309602 |
| Stainless steel washer | Superior Washer | 81610 |
| 24-well plate | VWR | 353047 |
References
- Rockwood, D., Preda, R. C., Yucel, T., Wang, X., Lovett, M. L., Kaplan, D. L. Materials Fabrication from Bombyx mori Silk Fibroin. Nature protocols. , (2011).
- Lawrence, B., Omenetto, F., Chui, K., Kaplan, D. Processing methods to control silk fibroin film biomaterial features. Journal of materials science. 43, 6967-6985 (2008).
- Altman, G., Diaz, F., Jakuba, C., Calabro, T., Horan, R., Chen, J. Silk-based biomaterials. Biomaterials. 24, 401-416 (2003).
- Hofmann, S., Wong, P. o., Foo, C., Rossetti, F., Textor, M., Vunjak-Novakovic, G., Kaplan, D. Silk fibroin as an organic polymer for controlled drug delivery. Journal of Controlled Release. 111, 219-227 (2006).
- Demura, M., Asakura, T. Immobilization of glucose oxidase with Bombyx mori silk fibroin by only stretching treatment and its application to glucose sensor. Biotechnology and bioengineering. 33, 598-603 (1989).
- Cebe, P., Kaplan, D. Mechanism of enzymatic degradation of beta-sheet crystals. Biomaterials. , (2010).
- Lawrence, B., Cronin-Golomb, M., Georgakoudi, I., Kaplan, D., Omenetto, F. Bioactive silk protein biomaterial systems for optical devices. Biomacromolecules. 9, 1214-1220 (2008).
- Meinel, L., Hofmann, S., Karageorgiou, V., Kirker-Head, C., McCool, J., Gronowicz, G. The inflammatory responses to silk films in vitro and in vivo. Biomaterials. 26, 147-155 (2005).
- Vepari, C., Kaplan, D. Silk as a biomaterial. Progress in Polymer Science. 32, 8-9 (2007).
- Li, M., Ogiso, M., Minoura, N. Enzymatic degradation behavior of porous silk fibroin sheets. Biomaterials. 24, 357-365 (2003).
- Arai, T., Freddi, G., Innocenti, R., Tsukada, M. Biodegradation of Bombyx mori silk fibroin fibers and films. Journal of Applied Polymer Science. 91, 2383-2390 (2004).
- Lawrence, B., Marchant, J., Pindrus, M., Omenetto, F., Kaplan, D. Silk film biomaterials for cornea tissue engineering. Biomaterials. 30, 1299-1308 (2009).
- Ma, X., Cao, C., Zhu, H. The biocompatibility of silk fibroin films containing sulfonated silk fibroin. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 78, 89-96 (2006).
- Patel, A., Thakar, R., Chown, M., Ayala, P. Biophysical mechanisms of single-cell interactions with microtopographical cues. Biomedical. , (2010).
- Jin, H., Park, J., Karageorgiou, V., Kim, U., Valluzzi, R., Cebe, P. Water-Stable Silk Films with Reduced β-Sheet Content. Advanced Functional Materials. 15, 1241-1247 (2005).
- Lawrence, B., Wharram, S., Kluge, J., Leisk, G., Omenetto, F., Rosenblatt, M. Effect of Hydration on Silk Film Material Properties. Macromolecular Bioscience. 10, 393-403 (2010).
- Zhang, Y. Natural silk fibroin as a support for enzyme immobilization. Biotechnology Advances. 16, 961-971 (1998).
- Cebe, P., Kaplan, D. Mechanism of enzymatic degradation of beta-sheet crystals. Biomaterials. , (2010).
- Shaw, J. Fractionation of the fibroin of Bombyx mori with trypsin. Biochemical Journal. 93, 45 (1964).
- Rice, W., Firdous, S., Gupta, S., Hunter, M., Foo, C., Wang, Y. Non-invasive characterization of structure and morphology of silk fibroin biomaterials using non-linear microscopy. Biomaterials. 29, 2015-2024 (2008).
- Chirila, T., Barnard, Z., Harkin, D., Schwab, I., Hirst, L. Bombyx mori silk fibroin membranes as potential substrata for epithelial constructs used in the management of ocular surface disorders. Tissue Engineering Part A. 14, 1203-1211 (2008).
- Hu, X., Shmelev, K., Sun, L., Gil, E. -. S., Park, S. -. H., Cebe, P. Regulation of Silk Material Structure by Temperature-Controlled Water Vapor Annealing. Biomacromolecules. 12, 1686-1696 (2011).
- Omenetto, F., Kaplan, D. A new route for silk. Nature Photonics. 2, 641-643 (2008).
- Bray, L. J., George, K. A., Ainscough, S. L., Hutmacher, D. W., Chirila, T. V., Harkin, D. G. Human corneal epithelial equivalents constructed on Bombyx mori silk fibroin membranes. Biomaterials. 32, 5086-5091 (2011).
- Wang, N., Tytell, J. D., Ingber, D. E. Mechanotransduction at a distance: mechanically coupling the extracellular matrix with the nucleus. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 75-82 (2009).
- Jaalouk, D. E., Lammerding, J. Mechanotransduction gone awry. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 63-73 (2009).
