Parkinson Hastalığında nöropeptitler MALDI Görüntüleme Kütle Spektrometresi

Protokolü, genellikle birden fazla sıçan beyin kesitleri, 20-30 bölümleri ile MALDI IMS verilerine istatistiksel analiz amaç için ayarlanabilir ve doku hazırlanması oluşan beş farklı adımlardan oluşur, matris uygulaması, MALDI-TOF MS analizleri, veri değerlendirme, ve nöropeptid tanımlama. Prosedürler özetlenen ve aşağıda daha ayrıntılı olarak tarif edilmiştir: 1. Doku hazırlık Bu prosedür, ilgili doku örneklerinin toplanması gibi doku IMS analizi için kesit içerir. Proteolitik degradasyona önlemek için belirli bir amacı, bir protein ve peptid analizi. Bu nedenle doku diseksiyonu sırasında hızlı ve gayretli çalışmak esastır. Dekapitasyon yoluyla sıçan (genellikle 250-300 g) Kurban, -80 ° C derin dondurucuda aktarmadan önce toz kuru buz <30'lu ve dondurma maksimum post-mortem bir süre içinde sıçan beyin kaldırın. Sıvı azot kullanarak daha hızlı dondurulmasımatriks kristalizasyon olumsuz etkileyecektir beyin dokusu, microtears riskini artırabilir ve böylece MS kalitesini düşürür (Şekil 2D). Tüm beyinler MS sinyal kalitesi kaybı olmadan kesit önce birkaç yıl boyunca saklanabilir. 12 mikron dilimleri ve çözülme-mount doku kesitlerinde iletken MALDI cam slaytlar (indiyum kalay oksit kaplı slaytlar Bruker Daltonics,) ya da MALDI hedef (Şekil 2A-C) bir kriyostat mikrotom dondurulmuş doku kesin. -80 Vakum altında 15 dakika ve mağaza slaytlar Kuru bölümleri ° C daha sonra kullanmak kadar. -80 De bile saklanan doku kesitleri, kesit sonra mümkün olan en kısa süre içerisinde analiz edilmelidir ° C Biz MS sinyal kalitesini belirgin bir yıl depolamadan sonra azalacaktır bulabilirsiniz. Proteinler ve peptitler oksidasyon azaltmak amacıyla, depolama konteyner içindeki havanın, inert bir gaz (örneğin argon veya nitrojen) ile ikame edilebilir. 2. Matrix uygulama Matris uygulamasıadım, spektrum kalitesi üzerinde önemli bir etkiye sahiptir ve doku tür yanı sıra ilgi analit bağlı olarak birden fazla parametre optimizasyonu gerektirir. Bu faktörler, matris tür bir matris konsantrasyonu, pH, doku yıkama ve organik değiştiriciler aletsel ayarları depozitosu hacmi, 10 depolanmalar yanal çözünürlük ve sayısını (Şek. 2B) dahil olmak üzere yanı sıra gibi kimyasal parametreleri içerir. Büyük ölçekli deneyler için, örneğin bir gün içinde tüm bölümlerine matris uygulanarak ve aynı operatör tarafından azaltmak için, varyans analizi, büyük önem taşımaktadır. Yüceltme veya spreyi, küçük matris damlacıklarının dizilerin otomatik birikimi, tarafından, büyüklüğü 100-150 picolitre hakkında çeşitli dokularda küçük protein ve nöropeptid analizi için başarıyla kullanılmaktadır matris çözümü uygulamak amacıyla birçok strateji olmasına rağmen , beyin bölümlerde 9, 10,11, 12, 13 dahil olmak üzere. 1 saat için bir desikatöre buzunu kesitlerbizim. Deney operatör daha başka bir kişi tarafından kör olduğundan emin olun. Re-etiket örnekleri. 10 sn için% 70'lik etanol (EtOH, oda sıcaklığında, RT) bölümleri, yıkayıp 1x ve iki kez% 95 10 sn için EtOH (RT). Büyük deneyler için, yıkama için tüm cam gerçekleştirmek varyasyon en aza indirmek için bir küvet kullanılarak bir araya kayarak. 10 dk için bir desikatöre bölümlerde kurutun. Doku kesitleri mikroskop altında değerlendirilmesi ve, MALDI MS kalitesi (Şekil 2D) bozacağına doku bozulma, microtears ve küçük çatlaklar olup olmadığını kontrol edin. % 50 metanol, 10% 150mm, amonyum asetat (AMAC) ve suda% 0.3 triflüoroasetik asit (TFA) içinde 50 mg / mL DHB içeren taze matris çözeltisi hazırlayın. Matrix uygulama kimyasal bir mürekkep püskürtmeli yazıcı kullanarak bir dikdörtgen desen (CHIP, Shimadzu) kesikli damlacık birikimi ile yapılır. Birinci adım, deneysel matris uygulama parametreleri analizi includi nöropeptid için optimize etmek içinng sayısını geçişte başına damlacıkların geçer. Bu deney, her dizi gibi korpus kallosum, korteks ve striatum gibi benzer beyin bölgeleri kapsayan emin yaparken, aynı doku bölümünde farklı bir uygulama parametreleri ile çoklu matris dizileri uygulayarak tarafından yapılır. Farklı beyin yapıları, özel analitler hedefleyen farklı matrisler ve farklı matris solventler spesifik analitlerin çıkarılması için gerekli ise de dahil olmak üzere, her zaman parametreleri değiştirilir aynı deneyi yapılmalıdır Tarama doku bölümü ile cam slayt tutucu ve tutucu hizalamak. Doku bölümünde matris uygulaması için dizi tanımlayın ve mesafe nokta uzaysal çözünürlüğü, yani nokta belirtin. Kimyasal mürekkep püskürtmeli yazıcı üzerinde optimize edilmiş protokolü kullanılarak matris uygulayın. Bu deneme için aşağıdaki baskı parametreleri ile peptid görüntüleme için optimize edilmiş bir protokol kullanılır: 10 damla (100 pL / damla), 10 uygulama geçer ve d noktaya bir nokta300 um istance. Tarama son matrisi bölümleri tespit ve kayıt için MALDI veri toplama sistemi (3.4 adım) önce resmi kaydedin. De kullanıma kadar vakum altında bir desikatöre bölümlerde depolar. 3. MALDI MS veri toplama ve işleme Nöropeptidlerin MS analizi her matriks nokta 14 yazılım destekli veri toplama kullanarak,, MALDI zamanında uçuş aleti (Ultraflex II Bruker Daltonics,., Almanya) reflektör modu faaliyet yapılmaktadır. Bu nedenle doğru mekansal öğretim şarttır. Bu, MALDI optimizasyonu, satın alma ve özellikle hedef kaydı deneyler tercihen deney grupları kör olmalıdır aynı operatör tarafından yapılmaktadır esastır. Birden fazla cam slaytlar ile büyük ölçekli bir deneyde, başka bir kişi kimyasal mürekkep püskürtmeli yazıcı çalışırken MALDI deneyler, bir operatör tarafından yapılmalıdır. Kütle spektrometresi cam slaytlar yükleyin. MALDI etme yöntemi, düşük moleküler ağırlıktaki bir standart kalibrasyon karışımı (Bruker Daltonics) kullanılarak kalibrasyon kontrol. Satın alma parametrelerini optimize edin. MS sinyal için optimize etmek ve, komşu matris yataklarının matris ablasyonu önlemek için,, doku lazer ve optimum odak boyutu tespit edilmelidir. Lazer enerjisi pik çözünürlüğü veya doyurarak dedektör azaltarak, taban yükseltme olmadan mümkün olduğunca çok sayıda matris mevduat olarak maksimum MS kalitesini sağlamak ayarlanır. Sadece gürültü tespit edilir kadar matris noktaya başına çekim maksimum sayısını değerlendirmek, genellikle 1000-2000 çekim. Birikmiş olmalı ve bir spot içinde lazer pozisyonundan önce satın çekim numarasını değiştirmek gerekir çekim sayısını tahmin. Her matris nokta eşit örneklemek için, bir ran kullanarak 24 basamaklı olmak üzere toplam 25 atış adımda 600 çekim birikirhareket özgürlüğü desen, her matriks birikimi. Kayıt, MALDI aşamasında motor FlexImaging kullanarak koordinatları (v.2.0) 10 tüm lekeli bölümden tarama ve veri toplama AutoXexuteBatchRunner.exe yazılım toplu modunda gerçekleştirmek. Bazal çıkarma (Konveks gövde V3), yumuşatma ve bir ASCII dosyası (*. Dat, *. Txt veya *. Csv formatında) ihracat takip harici kalibrasyon (isteğe bağlı) sayesinde, tek tek her spektrumları işleyin. 15 4. Verilerin değerlendirilmesinde Final veri değerlendirme, sadece zirve bilgi, istatistiksel analiz takip odaklanmak sonrası kısıtlı veri işleme ve veri azaltma oluşmaktadır. Bir ilk adım olarak, MALDI IMS bölümleri overnormalization etkileri değerlendirildi. Bu veri görselleştirme, böyle FlexImaging (Bruker Daltonics) veya BioMap (Novartis) gibi araçlar kullanılarak kolaylıkla elde edilebilir. Bir ilk adım olarak toplam iyon görüntüleri evatoplam iyon akımı (EFT) normalleştirme önce luated, çeşitli önde gelen peptid zirveleri tek iyon dağıtım görüntüleri elle muayene ile takip etti. Karakteristik tepe yoğunluğu dağıtımları için bak ve kalite veya normalleşme etkiler (Şekil 3) lekelenme, doku özellikleri (tazminat) ilgili. Histolojik özellikleri göre çıkarlarının bölgelerde (striatum örneğin) tasvir ve ASCII dosya biçiminde karşılık gelen spektrumları ihracat. Tercihen, bu aşamada,, toplam iyon akımı (TIC) spektrumları normale yapılabilir. Böyle bir Menşei olarak veri işleme yazılımı (v.8.1 Originlab), MATLAB (MathWorks, Natick, MA, ABD) veya R 16 ASCII dosyalarına alma. Tepe tespiti örneğin Köken ya da Matlab "mspeaks" "zirve analizi" için yazılıma dahil tepe bulma araçları kullanılarak yapılabilir. Tek bir sekme ayrılmış metin dosyası olarak dışa aktarın. Tüm spektrumu peaklists de Tespit peptid bin sınırları belirlemek amacıylazirveleri, binning analizi uygun yazılım araçları kullanılarak (örn. pbin 17) ya da in-house MATLAB veya R için komut dosyası yazılı tüm pik içeren tek bir metin dosyası veri aldı yazılımı yüklenir ve pik sınır belirlenmesi için bir parametre belirtilmemişse deney için ilgili olduğu için bir zirve spektrumları mevcuttur ne sıklıkta olmalıdır gibi. Örneğin, deneyi, hayvanların 2 grupları, (5) her gruptaki hayvanların, ve her bir hayvan ve ilgi bölgenin toplanan 100 spektrası içerir. Hayvanların bir grup, (3/5) ve bu hayvanlarda spektrumları (3×50 = 150 spectra) en az yarısı, en azından büyük çoğunluğu mevcut ise, potansiyel olarak ilginç bir tepe varsayınız, toplam yüzdesi verecek için% 15, toplam 1000 (2x5x100) spektrumları 150 olumlu spektrumları dışarı. Pbin aracını kullanarak, bu adımı, bin genişlikleri elde edilen verilerin belirlenen tüm içeren tek bir binrange dosya verir. O bin sınırları doğrulamak içinuygun olan, bunun özgün spektrası izleri ile birlikte konteynerleri görselleştirmenizi Origin kolaydır. Pik alan entegrasyonu, istatistiksel analiz için önemlidir varyans azaltabilir. 4. adımda belirlenen pik sınırları arasında eğri altında kalan alanı hesaplamak için bir in-house yazılmış betiklerin R için kullanın. Entegre pik alanları 18 yapılır SAM aracını kullanarak non-parametrik eşleştirilmemiş test yoluyla MS excel (v.2007) ve istatistiksel analiz alınır. 5.. Peptid tanımlama Gözlenen peptid kimliklerin Sıra doğrulama biyolojik alaka sonuçlandırmak için son derece önemlidir. Yüksek peptid konsantrasyonları 12,13 analizi bu tür için gerekli olmasına rağmen, en doğru yaklaşım, doğrudan tandem kütle spektrometresi (MS / MS) vasıtasıyla peptid parçalanma kullanarak doku kapalı gerçek yukarıdan aşağıya belirlenmesini de içerir. Düşük, clos ile bol peptid veya birden peptidler içinem / z değerleri (±% 0.5), doku analizi bozulur ve kapalı bir doku analizi bir peptidomic stratejisi kullanılarak, ekstraksiyon, ayrılması ve endojen nöropeptidlerin MS bazlı tanımlama içerir kullanılmaktadır. Burada sunulan deneme için, merkezi odak opioid peptid tespiti, bu peptidler spektrumu diğer nöropeptitlerin ile karşılaştırıldığında bol oldukça düşük olduğundan, belirli bir sorundur. Ayrıca, ortak peptid ekstraksiyonu ve ayırma teknikleri ile korumak için onları oldukça hidrofilik ve zor kılan bu peptidler yerine polar .. Bu nedenle biz, peptid kimlik 9,19 dayanarak standart LC-MS/MS birlikte doku ekstraksiyonu ve opioid peptid prefractionation için önceden bildirilen protokolü uyguladık. Ilgi hedef yapılara (kaudat putamen, CPU çekirdeği akumbens, NAC) koronal kesitler toplayın. Bir kriyostat mikrotom Mount donmuş sıçan beyin ve çevreleyen beyin malzeme çıkarmak (kortex, bir neşter ile septum, korpus kallosum). Disseke NAC CPU ve çözülme NAC ve farklı cam slaytlar bölümden CPU parçalar monte; bölümler (n = 50 30 mikron) toplayın. Iki dakika inkübe 100 mcL% 5 ACN/0.1% TFA ekleyerek doku kapalı peptidler ayıkla ve eppendorf düşük protein bağlayıcı tüpler içinde toplamak. Bu adım iki kez tekrarlayın. Peptid prefractionation güçlü katyon değişim kromatografisi vasıtasıyla, artan iyonik kuvveti 19 stepwise (n = 4), elüsyon kullanılarak gerçekleştirir. Vakum altında bir speedvac konsantratörü kullanan numuneler kurulayın. Nanoflow C18 ters faz sıvı kromatografisi, elektrosprey tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) arabirim sayesinde (1100, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) tarafından peptid fraksiyonları analiz edin. MS deneyler, lineer iontrap / Fourier dönüşümü iyon siklotron rezonans (FTICR) melez bir cihaz (LTQ FT 7T, Thermo Scientific, Waltham, MA) Peptid fulscan spektrumu (m / z 150 tarihinde yapıldı-2000), Müteakip, çarpışma endüklenen, ayrışma (CID) 9 yoluyla iontrap 5 en yoğun bir peptid zirveleri fragmentasyonu tarafından takip yüksek kütle çözünürlüğü (100,000) FTICR analizörü ile elde edilmiştir. Peptide sekansı tanımlama veri tabanında eşleme tarafından gerçekleştirilir ve de novo dizi analizi ile tamamlanır edilebilir. Veritabanı arama için, piyasada bulunan arama motorları (Mascot, XTandem veya Protein fırsatçı) 20 istihdam edilmektedir. Aramalar genellikle bilinen veya tahmin nöropeptid ve nöropeptid habercisi proteinlerinin 21 dizileri dizileri içeren veritabanlarına karşı yapılmaktadır. 6. Temsilcisi Sonuçlar Burada tarif edilen protokol, tekabül eden yaklaşık 300 Monoizotopik molekül türü (gösterilen ortalama spektrası için 1.000 'den daha fazla zirveleri tespiti ile sonuçlanmıştır göre hazırlanan striatal doku bölümlerini MALDI görüntüleme kitle spektrometrisiŞek. 1). Önde gelen moleküler iyon pikleri için veri görselleştirme Flex Görüntüleme yazılımı kullanarak elde etti ve anatomik özellikleri (Şekil 3) ile uyumlu iyi karakteristik pik şiddetlerinin dağılımı gösterdi. MALDI IMS bir diğer özelliği de görece iyi tekrarlanabilirlik. Bu deney,% 30 tepe noktası tespit edilen tüm molekül türü yoğunlukları için, varyans genel katsayısı, ama birçok zirveleri çok düşük bir varyasyon ve tedavi grupları (Şek. 4) içinde yüksek tekrarlanabilirlik görüntülenir. Ilgi hem lezyonlu ve sağlam striata dorsolateral ve dorsomedial bir bölümü dahil olmak üzere dört farklı bölgede, relatif zirve yoğunluğu verileri istatistiksel analize tabi tutuldu. Aynı anda çoklu karşılaştırmalar için ayarlamak için, istatistiksel analiz, 18 SAM aracı kullanarak parametrik olmayan test yoluyla yapıldı. En belirgin değişiklikler, dopamin Denerve, parkinson striatum dorsolateral parçası bulundu. İşte si , dynorphin B ve alfa-neoendorphin (Şekil 5); farklı tedavi grupları arasında orada önemli değişiklikler iki dynorphin peptidler için gözlenmiştir. Ayrıntılı olarak, hem dynorphin pik şiddetleri% 50-60 oranında göreceli bir artış, düşük, diskinetik hayvanlar ve lezyon denetimleri (karşılaştırıldığında yüksek diskinetik hayvanlarda gözlendi p <0.05, F (2, 15) = 12.8 DynB, F = 5.7 aNeo; Şekil 5). Kaudat putamen (CPU) ve nükleus akumbens (NAC); Şekil 1 Ortalama MS iki striatum yakından ilişkilidir bölgelerden elde izler. Iki bölgede benzersiz bir bölgede ifade bazı moleküler türleri ile farklı MS profillerin görüntülemek veya farklı tepe yoğunluğu seviyelerde (insert, m / z 2028). Her tepe mekansal dağılım deseni, özel bir görüntüleme yazılımı (alt panel) kullanılarak görüntülenebilir. "2.jpg /> Şekil 2 (A), beyin, bir gömme medya (OTC; ok) kullanılarak bir kriyostat chuck üzerine monte edilir., Tezgah üstü beynin kesitli, peptidlerin OTC nedeni iyon supresyon yana olmak alanında kontamine gelmez özen. (B, C) İnce bölümler (≈ 12 mikron kalınlığında) çıplak gözle tespit etmek zor olabilir, MALDI uyumlu cam Slaytlarınıza çözülme monte ve C. (D) Microtears görüldüğü gibi, donma hasarı önlemek için birkaç saniye için kurutuldu ama MALDI matris kristalizasyon bozan ve MALDI MS sinyal yoketmek. , Cresyl menekşe ile boyanarak aynı bölümde microtears ve çatlaklar (sağ alt fotomikrografıdır) ortaya koymaktadır. Şekil 3 Verilerin değerlendirilmesinde ilk adım (AI) analiz kütle aralığı boyunca birkaç farklı zirveleri görselleştirmek için. Burada, 9 farelerin striatal bölümlerde, MALDI MS ile görüntülendi. Ortalama toplam Görselleştirme imevcut alanlarda göze çarpan yüksek veya düşük iyon yoğunlukları (oklar) ortaya çıkaracaktır. Bu alanlar üzerinde veya altında normalleşme etkileri ve sonuçları ödün deforme veri analizi tarafından etkilenebilir. Kötü anatomik pik dağılımları tanımı I. aracılığıyla, örneğin bölüm 3 ve 9, genellikle düşük tepe sinyal-gürültü ile zirveleri F bölümleri ortaya Şekil 4 tedavi grupları arasında MS tekrarlanabilirlik ortalama MS iz ve her m / z değeri (ekler, m / z 722 ve 1749) için standart hata hesaplanırken değerlendirilebilir. İyi tekrarlanabilirlik geçerli istatistiksel analiz sağlar. Şekil 5 dynorphin B ve, alfa neoendorphin pik şiddetlerini, 6-OHDA, önemli ölçüde artmıştırLezyonlu, parkinsona, yüksek-diskinetik hayvanların striatum (HD; oklar), düşük-diskinezi (LD) ve lezyon kontrol grubuna (LC) için karşılaştırılmıştır. Peptid pik şiddetlerini, sağlam tarafın ortalama kat-değişim ± SEM (intakt / lezyon tarafı) olarak ifade edilir. * P <0.05; cx korteks; cc korpus kallosum. Ölçek çubuğu 5 mm.