MALDI הדמיה ספקטרומטריית מסה של נוירופפטידים אצל חולי פרקינסון

פרוטוקול מותאם לצורך ניתוח סטטיסטי של נתוני ה-IMS MALDI ממספר חלקים במוח חולדה, בדרך כלל 20-30 חלקים, והוא כולל חמישה שלבים שונים הכוללים הכנת הרקמה, מטריקס יישום, MALDI-TOF MS ניתוח, הערכת הנתונים, neuropeptide זיהוי. הנהלים מתוארים ו המתואר מפורט יותר בהמשך: 1. רקמת הכנה הליך זה כולל אוסף של דגימות רקמה, בהתאמה, כמו גם רקמות חתך לניתוח IMS. המטרה מסוים בחלבון וניתוח פפטיד היא למנוע הידרדרות פרוטאוליטים. לכן חשוב לעבוד מהר וחרוץ במהלך דיסקציה רקמות. להקריב חולדות (בדרך כלל 250-300 גר ') על ידי עריפת ראש, להסיר במוח החולדה בתוך זמן שלאחר המוות המרבי של ה -30 <ואת הקפאת קרח יבש אבקת לפני העברה המקפיא -80 ° C. מהר הקפאה באמצעות חנקן נוזלילהגביר את הסיכון microtears ברקמת המוח, אשר להשפיע לרעה על התגבשות מטריקס ועל ידי כך להפחית את איכות טרשת נפוצה (איור 2 ד). המוח כולו יכול להיות מאוחסן במשך מספר שנים לפני חתך ללא איבוד איכות האות MS. חותכים רקמת קפוא על microtome cryostat ל -12 פרוסות מיקרומטר ו ההפשרה-mount קטעי רקמה על מוליכים MALDI שקופיות זכוכית (תחמוצת אינדיום בדיל שקופיות מצופים, Bruker Daltonics) או MALDI היעד (איור 2 א, ג). קטעים יבשים במשך 15 דקות תחת ואקום שקופיות לאחסן -80 ° C עד לשימוש נוסף. קטעי רקמה יש לנתח בתוך זמן קצר ככל האפשר לאחר חתך, גם אם הם נמצאים -80 ° C. אנו מוצאים כי איכות האות MS יופחת במידה ניכרת לאחר שנה בתחום האחסון. על מנת להקטין חמצון של חלבונים ופפטידים, אוויר במיכל האחסון יכול להיות מוחלף עם גז אינרטי (למשל ארגון או חנקן). 2. מטריקס יישום יישום מטריקסצעד יש השפעה משמעותית על איכות הספקטרום דורש אופטימיזציה של פרמטרים רבים בהתאם לסוג הרקמה, כמו גם אנליטי של עניין. גורמים אלה כוללים פרמטרים כימיים כגון סוג של מטריקס, מטריקס ריכוז, pH, שטיפת רקמות מכפילי אורגניים, כמו גם הגדרות אינסטרומנטלי כולל נפח ההפקדה, ברזולוציה המספר לרוחב של 10 תצהירים (איור 2 ד). ניסויים בקנה מידה גדול, יש חשיבות רבה כדי להפחית את השונות, למשל על ידי הפעלת מטריקס לכל החלקים בתוך יום אחד, על ידי מפעיל אחד. אם כי יש אסטרטגיות רבות ליישם פתרון מטריקס למשל באמצעות סובלימציה או על ידי ריסוס, בתצהיר אוטומטי של מערכים של מטריקס טיפות קטנות, על picoliter 100-150 בגודל, שימש בהצלחה לניתוח חלבונים נוירופפטידים קטנים ברקמות שונות , כולל חלקים במוח 9, 10,11, 12, 13. להפשיר את הסעיפים dessicator עבור 1 Hשלנו. לוודא כי הניסוי עיוור על ידי אדם שאינו מפעיל. Re-label כל דגימות. לשטוף חלקים 1x באתנול 70% (EtOH, בטמפרטורת החדר, RT) עבור 10 שניות ופעמיים 95% EtOH (RT) של 10 שניות. ניסויים גדולים, לבצע שטיפת כוס כל השקופיות ביחד באמצעות קובט על מנת לצמצם שונות. לייבש את הסעיפים dessicator במשך 10 דקות. להעריך חלקים הרקמה תחת מיקרוסקופ ולבדוק עיוות רקמות, microtears סדקים קטנים אשר יפגע MALDI MS איכות (איור 2 ד). הכן פתרון מטריקס טרי המורכב 50 מ"ג / מ"ל ​​DHB ב מתנול 50%, 10% אמוניום אצטט 150mm (AmAc) וחומצה trifluoroacetic 0.3% (TFA) במים. היישום מבוצע על ידי מטריקס בתצהיר אגל דיסקרטית בתבנית מלבנית באמצעות מדפסת הזרקת דיו כימיים (שבב, Shimadzu). הצעד הראשון הוא לייעל את הפרמטרים של הניסוי יישום מטריקס עבור neuropeptide ניתוח includiמספר ng של טיפות לכל כרטיס, מספר עובר. ניסוי זה מתבצע על ידי הפעלת מערכי מטריצה ​​עם מספר רב של פרמטרים שונים על יישום סעיף רקמה זאת, תוך הקפדה כי מערך זה מכסה אזורים במוח דומים כגון כפיס המוח, הקורטקס, ו הסטריאטום. את אותו הניסוי צריך להתבצע כל הזמן פרמטרים משתנים, כולל מבנים שונים במוח, מטריצת מיקוד שונות analytes ספציפיים, ואם ממיסים מטריקס שונים הדרושים להפקת analytes ספציפיים. לסרוק שקופיות זכוכית בעל סעיף רקמות ליישר בעל. הגדרת מערך שלך עבור יישום מטריקס בקטע רקמות ולציין את המקום מרחבית כלומר ברזולוציה לזהות מרחוק. החל מטריקס באמצעות פרוטוקול אופטימיזציה במדפסת הזרקת דיו כימי. לצורך ניסוי זה השתמשנו פרוטוקול אופטימיזציה עבור הדמיה הפפטיד עם הפרמטרים ההדפסה הבאים: 10 טיפות (100 PL / ירידה), 10 ו יישום עובר במקום לזהות Distance של 300 מיקרומטר. סריקה הסופית מטריקס הבחין חלקים ולשמור את התמונה אחת לפני רכישת נתונים MALDI (שלב 3.4). אחסן את הסעיפים עד לשימוש נוסף dessicator תחת ואקום. 3. MALDI MS רכישת נתונים ועיבוד ניתוח MS של נוירופפטידים מתבצע בזמן MALDI של מכשיר טיסה (UltraFlex השנייה, Bruker Daltonics, גרמניה) ההפעלה במצב רפלקטור, באמצעות רכישת התוכנה בסיוע נתונים מנקודה כל מטריצה ​​יחידה 14. הוראה מרחבית מדויקת ולכן היא הכרחית. זה חיוני כי אופטימיזציה MALDI, רכישת ובמיוחד רישום ניסויים היעד מתבצעות על ידי מפעיל אותו רצוי להיות עיוור לקבוצות הניסוי. בניסוי בקנה מידה גדול עם שקופיות זכוכית רבים, הניסויים MALDI יכול להתבצע על ידי מפעיל אחד בעוד אדם אחר פועל מדפסת הזרקת דיו כימי. טען שקופיות זכוכית לתוך ספקטרומטר מסה. בדוק את כיול של שיטת הרכישה באמצעות MALDI משקל מולקולרי נמוך תקן כיול תערובת (Bruker Daltonics). לייעל את הפרמטרים רכישה. על מנת לייעל את האות MS ולהימנע ablating מטריקס מפיקדונות מטריקס השכנות, בגודל של הלייזר ואת המיקוד האופטימלי על רקמת יש לקבוע. אנרגיית הלייזר נקבע על מנת להבטיח איכות מקסימלית של MS כמו פיקדונות מטריקס רבים ככל האפשר ללא הרמת המחקר, הפחתת רזולוציית שיא או להרוות את גלאי. להעריך את המספר המרבי של יריות לכל מקום מטריצה ​​עד הרעש היחיד מזוהה, בדרך כלל 1000-2000 יריות. להעריך את מספר יריות כי יש שנצברו ומספר יריות שנרכשו לפני העמדה לייזר בתוך המקום צריך לשנות. על מנת לדגום את כל מטריצה ​​שווה נקודה, אנחנו צוברים 600 יריות ב -25 צעדים ירה, מספר כולל של 24 צעדים באמצעות רןDOM דפוס התנועה, החל בתצהיר כל מטריצה. הרשמה סריקה של כל החלקים המנוקדים לקואורדינטות המנוע של השלב MALDI באמצעות FlexImaging (v.2.0) 10 ולבצע רכישת נתונים במצב אצווה על ידי תוכנה AutoXexuteBatchRunner.exe. לעבד כל ספקטרום אחת באמצעות המחקר חיסור (קמורה גוף V3), החלקה וכיול חיצוני (לא חובה), ולאחר מכן לייצא כקובץ ASCII (*. DAT, *. Txt או *. בפורמט CSV). 15 4. נתוני הערכה סופי הערכה כוללת נתונים עיבוד נתונים פוסט והפחתת נתונים על ידי התמקדות רק על מידע השיא, ואחריו ניתוח סטטיסטי. כצעד ראשון, IMS בסעיפים MALDI הוערכו על תופעות overnormalization. זו יכולה להיות מושגת בקלות על ידי שימוש בכלים נתונים להדמיה כגון FlexImaging (Bruker Daltonics) או BioMap (נוברטיס). כצעד ראשון את התמונות יון הכל הם אווהluated לפני הנוכחי הכולל נורמליזציה (עוית) יון, ואחריו בדיקה ידנית של יחיד הפצה תמונות יון של פפטידים שונים פסגות בולטות. חפשו הפצות בעוצמה האופייניים השיא ואם הם קשורים לתכונות רקמות (פיצויים), איתור איכות או נורמליזציה אפקטים (איור 3). להתוות אזורים של אינטרסים (למשל הסטריאטום) לפי תכונות היסטולוגית ולייצא את הספקטרום המתאים תבנית קובץ ASCII. רצוי, נורמליזציה של הספקטרום כדי הנוכחי יון הכולל (עוית) ניתן לבצע בשלב זה. ייבוא ​​קבצים של ASCII בתוכנה נתוני הטיפול כגון מוצא (v.8.1, Originlab), MATLAB (MathWorks, Natick, מסצ'וסטס, ארה"ב) או R 16. איתור השיא יכול להתבצע באמצעות כלים מציאת שיא הכלולות בתוכנה, למשל "ניתוח השיא" של מקור או "mspeaks" ב Matlab. לייצא את peaklists מן הספקטרום כל אחד מופרד קובץ יחיד הכרטיסיה טקסט. על מנת לקבוע גבולות סל על פפטיד לאתרפסגות, ניתוח binning מתבצע באמצעות כלי תוכנה מתאימה (למשל pbin 17) או בתוך הבית נכתב תסריטים MATLAB או ר 'כאן קובץ טקסט יחיד המכיל את כל נתוני שיא הרים הוא נטען לתוך התוכנה את הפרמטרים לקביעת הגבול השיא שצוינו כמו למשל כמה פעמים השיא צריך להיות נוכח ספקטרום כדי להיות רלוונטי לניסוי. לדוגמה, ניסוי מכיל 2 קבוצות של בעלי חיים, בעלי חיים 5 בכל קבוצה, וכן 100 ספקטרום נאספים כל חיה ואת האזור של עניין. נניח שיא מעניין פוטנציאל אם הוא קיים ברוב לפחות של בעלי החיים בקבוצה 1 (3/5) במחצית לפחות של הספקטרום של בעלי חיים אלה (3×50 = 150 ספקטרה), זה ייתן אחוז בסך הכל של 15% עבור ספקטרום 150 חיובית מתוך סך ספקטרה (2x5x100) 1000. באמצעות כלי pbin, צעד זה יוצר קובץ אחד המכיל את כל binrange רוחב סל שנקבעו מנתוני שנרכשו. על מנת לוודא כי גבולות סלמתאימים, קל לדמיין את פחי במקור יחד עם עקבות ספקטרום המקוריים. שיא בתחום האינטגרציה יכולה להפחית את השונות כי חשוב לצורך ניתוחים סטטיסטיים. אנו משתמשים סקריפט בתוך הבית נכתב על R כדי לחשב את השטח מתחת לעקומה בין גבולות השיא שנקבעו בשלב 4. אזורי שיא משולבים מיובאים MS Excel (v.2007) וניתוח סטטיסטי באמצעות בדיקות לא פרמטרית מזווג באמצעות הכלי SAM מתבצע 18. 5. הפפטיד זיהוי רצף של אימות זהותם פפטיד הנצפות חיונית על מנת לסיים את הרלוונטיות הביולוגית. הגישה המדויקת ביותר כוללים קביעה נכונה מלמעלה למטה באופן ישיר את הרקמה באמצעות פיצול הפפטיד באמצעות טנדם ספקטרומטריית מסה (MS / MS), אם כי בריכוזים גבוהים פפטיד נדרשים עבור סוג זה של ניתוח 12,13. עבור פפטידים שפע נמוכות או פפטידים רבים עם קלולהם להילחם / ערכי Z (± 0.5%), על רקמת ניתוח נפגעת וניתוח רקמות את השימוש באסטרטגיה peptidomic מנוצל הכוללת, חילוץ הפרדה וזיהוי מבוסס MS של נוירופפטידים אנדוגניים. לצורך ניסוי המובא כאן, מוקד מרכזי על זיהוי הפפטיד אופיואידים, שהוא אתגר מיוחד מאז פפטידים אלה הם נמוכים למדי בשפע לעומת נוירופפטידים אחרים הספקטרום. יתר על כן, פפטידים אלה קוטבי למדי מה שהופך אותם הידרופילי יחסית וקשה לשמור עם מיצוי הפפטיד משותף טכניקות הפרדה .. לכן אנחנו מוחלים פרוטוקול שדווח קודם לכן להפקת רקמות prefractionation פפטידים אופיואידים בשילוב עם LC-MS/MS סטנדרטיים המבוססים זיהוי הפפטיד 9,19. איסוף חלקים העטרה של מבנים היעד של עניין (הגרעין הנסמך, NAC, caudate putamen, CPU). הר המוח עכברוש קפוא microtome cryostat ולהסיר חומר המוח שמסביב (corטקס, מחצה, כפיס המוח) עם אזמל. איסוף חלקים (30 מיקרומטר, n = 50) של NAC גזור ואת המעבד ההפשרה הר NAC חלקי המעבד של החלקים על שקופיות זכוכית שונים. חלץ פפטידים מעל הרקמה על ידי הוספת 100 TFA μL 5% ACN/0.1%, דגירה במשך שתי דקות ולאסוף במבחנות eppendorf חלבון נמוכה מחייב. חזור על פעולה זו פעמיים. בצע prefractionation הפפטיד באמצעות כרומטוגרפיה קטיון חזק חילופי באמצעות elution בשלבים (n = 4) בעוצמה מוגברת יוני 19. לייבש את דגימות תחת ואקום באמצעות concentrator speedvac. לנתח את השברים הפפטיד באמצעות כרומטוגרפיה C18 nanoflow הפוך שלב נוזלי (1100, Agilent Technologies, סנטה קלרה, קליפורניה) interfaced כדי electrospray טנדם ספקטרומטריית מסה (LC-MS/MS). ניסויים של MS בוצעו על ליניארי היברידית iontrap / התמרת יון הציקלוטרון תהודה (FTICR) (LTQ FT 7T, Thermo Scientific, Waltham, MA,) מכשיר פפטיד fulscan ספקטרה (m / z 150-2000) נרכשו עם נתח FTICR ברזולוציה גבוהה המונית (100000) בעקבות הפיצול הבאות של פסגות ב -5 פפטיד אינטנסיבי ביותר iontrap באמצעות התנגשות המושרה דיסוציאציה (CID) 9. זיהוי רצף הפפטיד נעשה על ידי התאמת הנתונים ניתן כהשלמה לניתוח רצפי דה נובו. לחיפוש מסדי נתונים, מנועי חיפוש מסחריים (Mascot XTandem או חלבון מחפש) מועסקים 20. החיפושים מתבצעים בדרך כלל מול מסדי נתונים המכילים רצפים של נוירופפטידים ידועים או חזה רצפים של חלבונים מבשר ונוירופפטידים 21. 6. נציג תוצאות MALDI הדמיה ספקטרומטריית מסה של חלקים רקמות striatal כפי שהוכן על פי הפרוטוקול המתואר כאן הביא זיהוי של יותר מ -1000 פסגות המקביל ל כ 300 מינים מולקולרית monoisotopic (ספקטרום הממוצע המוצגבאיור. 1). נתונים להדמיה עבור בולטים פסגות יונים מולקולריים הושגה באמצעות תוכנת הדמיה Flex והראה האופייניים עוצמת שיא הפצות כי הם גם בקנה אחד עם תכונות אנטומיות (Fig.3). תכונה נוספת של MALDI IMS הוא שחזור טוב היחסי. בניסוי זה, הכולל מקדם השונות עבור עוצמות השיא של כל המינים מולקולרית זוהה היה 30%, אך פסגות רבות מוצגת וריאציה נמוך מאוד שחזור גבוהה בתוך קבוצות הטיפול (איור 4). עוצמה יחסית לשיא נתונים של ארבעה אזורים שונים של עניין, כולל חלק דורסולטרלי ו dorsomedial של striata הן lesioned ושלמה היו נתונים ניתוח סטטיסטי. על מנת להתאים להשוואות מרובות בו זמנית, הניתוח הסטטיסטי בוצע באמצעות בדיקה פרמטרית באמצעות הכלי SAM 18. השינויים הבולטים ביותר נמצאו בחלק דורסולטרלי של הסטריאטום, דופמין denervated פרקינסון. כאן Si שינויים ב gnificant בין קבוצות הטיפול השונות נצפו שני פפטידים dynorphin; dynorphin B ו-alpha-neoendorphin (necatrix תמונה 5). בפירוט, עלייה של קרוב משפחה של שתי עוצמות השיא dynorphin ידי% 50-60 נצפתה אצל בעלי חיים dyskinetic גבוהה בהשוואה לבעלי חיים dyskinetic נמוכות ובקרות הנגע (p <0.05, F (2, 15) = 12.8 DynB, F = 5.7 aNeo; איור. 5). . איור 1 ממוצע MS עוקב לקבל שני אזורים קרובים של הסטריאטום, caudate putamen (CPU) ואת הגרעין הנסמך (NAC). שני אזורים שונים להציג פרופילים טרשת נפוצה עם כמה מינים מולקולרית לידי ביטוי באופן ייחודי באזור 1, או ברמות עוצמה שונות השיא (הוספה, מ '/ z 2028). דפוס הפריסה המרחבית של שיא כל ניתן דמיינו באמצעות תוכנת הדמיה מתמחה (הפאנל התחתון). 2.jpg "/> איור 2 (א) המוח הוא רכוב על צ'אק cryostat באמצעות התקשורת הטבעת (OTC: חץ)., טיפול נלקחת כי OTC לא לזהם את האזור של המוח להיות מחולק מאז דיכוי יון הגורם OTC של פפטידים. (ב, ג) סעיפים דק (עובי ≈ 12 מיקרומטר) הם ההפשרה רכוב על גבי שקופיות MALDI זכוכית תואם יבשים במשך כמה שניות כדי למנוע נזק ההקפאה כפי שניתן לראות ג (ד) Microtears עלול להיות קשה לזהות בעין בלתי מזוינת , אבל לפגוע התגבשות MALDI מטריקס למחוק אות MALDI MS. באותו סעיף מוכתם סגול cresyl מגלה microtears וסדקים (photomicrograph הימנית התחתונה). איור 3. הצעד הראשון בהערכת הנתונים לדמיין פסגות שונים על פני טווח המוני ניתח (AI). כאן, סעיפים striatal מ -9 עכברים היו צילמו MALDI עם טרשת נפוצה. ויזואליזציה של סך הממוצע אניעל הנוכחי יגלה תחומי בולטים יון עוצמות גבוהות או נמוכות (חיצים). תחומים אלה יכולים להיות מושפעים מעל או מתחת נורמליזציה אפקטים לעקוש ניתוח נתונים להתפשר על התוצאות. הגדרה אנטומית לקויה של הפצות השיא לחשוף חלקים עם שיא נמוך בדרך כלל האות לרעש, למשל סעיפים 3 ו -9, F פסגות דרך I. איור 4. שחזור MS בין קבוצות הטיפול ניתן להעריך על ידי חישוב הממוצע MS זכר ואת שגיאת התקן עבור ערך מ '/ ת כל (מוסיף, מ' / z 722 ו 1749). שחזור טוב מבטיח ניתוח סטטיסטי תקף. איור 5. Dynorphin B ו-alpha-neoendorphin בעוצמות שיא עולה במידה ניכרת ב 6-OHDA-Lesioned, פרקינסון, הסטריאטום גבוהה dyskinetic חיות (HD, חיצים) בהשוואה לקבוצת הביקורת נמוכה dyskinetic (LD) ואת הנגע (LC). עוצמות השיא פפטיד כפי שבאה לידי ביטוי בשינוי של פי הממוצע של הצד שלם ± SEM (נגע / פגע בצד). * P <0.05; CX קליפת המוח; callosum קורפוס סמ"ק. בר בהיקף 5 מ"מ.