MALDI الطيف الكتلي التصوير من نيوروببتيد في مرض باركنسون
Summary
الدوبامين استبدال العلاج الدوائي باستخدام لام دوبا هو العلاج الأكثر شيوعا من أعراض مرض باركنسون، لكن يرافقه من الآثار الجانبية بما في ذلك تحركات غير طبيعية غير الطوعي، وخلل الحركة ووصف<sup> 1</sup>. هنا، يتم تقديم بروتوكول للكتلة MALDI التصوير الطيفي أن يكشف تغيرات في مستويات الفئران neuropeptide الدماغ المرتبطة خلل الحركة.
Abstract
MALDI تصوير الطيف الكتلي (IMS) هو نهج القوية التي تسهل التحليل المكاني للأنواع الجزيئية في عينات الأنسجة البيولوجية 2 (Fig.1). ويغطي القسم A 12 ميكرون رقيقة الأنسجة مع مصفوفة MALDI، مما يسهل والامتزاز التأين من الببتيدات سليمة والبروتينات التي يمكن الكشف عنها مع محلل الشامل، وذلك باستخدام عادة MALDI TOF / TOF مطياف الكتلة. عموما يمكن أن تقيم مئات من القمم في مقطع واحد الفئران أنسجة المخ. وعلى النقيض من تقنيات التصوير المستخدمة، وهذا النهج لا يتطلب معرفة مسبقة من الجزيئات من الفائدة ويسمح للتحليل غير خاضعة للرقابة وشاملة من الأنواع الجزيئية متعددة مع الحفاظ على خصوصية الجزيئية العالية وحساسية 2. نحن هنا وصف نهج IMS MALDI مقرها لتوضيح ملامح التوزيع الخاصة بكل منطقة من نيوروببتيد في الدماغ الفئران من مرض حيوان نموذج الشلل الرعاش (PD).
PD هو مرض شائع الاعصاب مع انتشار قدرها 1٪ بالنسبة للأشخاص فوق سن 65 من العمر 3،4. ويستند العلاج الأكثر شيوعا أعراض على استبدال الدوبامين باستخدام لام دوبا 5. لكن يرافق ذلك من خلال آثار جانبية خطيرة بما في ذلك تحركات غير طبيعية غير الطوعي، ووصف لام دوبا الناجم عن خلل الحركة (غطاء) 1،3،6. واحد من التغيير الجزيئي الأبرز في LID هو upregulation من مرنا السلائف prodynorphin الأفيونية 7. والببتيدات dynorphin تعدل العصبي في مناطق الدماغ التي تشارك أساسا في مراقبة الحركة 7،8. لكن، حتى الآن على وجه الدقة الببتيدات الأفيونية التي تنشأ من تجهيز السلائف neuropeptide لم يتميز. ولذلك، تستخدم نحن MALDI IMS في نموذج حيواني من مرض باركنسون والتجريبية لام دوبا خلل الحركة التي يسببها.
أثبتت MALDI التصوير قياس الطيف الكتلي ليكون من المفيد وخاصة فيما يتعلق characteriza neuropeptideنشوئها، منذ النهج الأجسام المضادة المستخدمة القائم يستهدف سلاسل الببتيد معروف سابقا، ولاحظ التعديلات بعد متعدية. على النقيض من ذلك يمكن أن MALDI IMS كشف رواية تجهيز المنتجات الببتيد، وبالتالي تكشف عن الآليات الجزيئية الجديدة من تعديل neuropeptide من انتقال الخلايا العصبية. في حين لا يمكن أن المبلغ المطلق من نيوروببتيد يحددها IMS MALDI، أن يرسم الوفرة النسبية للايونات الببتيد من أطياف الشامل، وإعطاء الأفكار حول تغيير مستويات في الصحة والمرض. في الأمثلة المعروضة هنا، تم العثور على شدة ذروة B dynorphin، ألفا neoendorphin وف المادة المراد زيادة كبيرة في ظهراني جانبي، ولكن ليس ظهراني إنسي، المخطط للحيوانات مع خلل الحركة الشديدة التي تنطوي على الوجه والجذع وعضلات orolingual (الشكل 5). وعلاوة على ذلك، كشفت MALDI IMS وجود علاقة بين شدة خلل الحركة ومستويات DES-التيروزين neoendorphin ألفا، وهو ما يمثل آلية لم تكن معروفة سابقا من inacti وظيفيvation من dynorphins في المخطط مثل إزالة N-محطة التيروزين يقلل من dynorphin في مستقبلات المواد الأفيونية قدرة ملزم 9. هذه هي أول دراسة على توصيف neuropeptide في LID باستخدام MALDI IMS، وإبراز النتائج المحتملة لهذه التقنية لتطبيقها في جميع مجالات البحوث الطبية الحيوية.
Protocol
Discussion
هناك العديد من المزايا المتمثلة في استخدام الطيف الكتلي MALDI التصوير في دراسة نيوروببتيد. ويمكن تحليل غير متحيز للبيانات MS تكشف عن أن نواة الدماغ معينة فقط، أو كما في النتائج المقدمة هنا حيث يرتبط فقط على جزء من المخطط ظهراني جانبي مع الحالة المرضية في جسم المريض معينة. عن طريق الإبقاء على المعلومات المكانية ومن ثم من الممكن لإعادة تحديد المناطق ذات الأهمية للتحليل احصائى مع حساسية أعلى، وانخفاض التقلبات مقارنة مع تحليل لأقسام الدماغ كله أو باستخدام التقليدية peptidomics دراسات على مقتطفات الببتيد. وبالإضافة إلى ذلك، من المهم أن ندرك MALDI IMS بسهولة يمكن الكشف لم تكن معروفة سابقا في مرحلة ما بعد التعديلات متعدية، ولكن التحليلات الهيكلية يجب أن تتبع لتحديد المواقع بدقة من الأحماض الأمينية التي يتم تعديلها.
المخاطر المشتركة في وضع الرؤية وIMS البيانات MALDI تشمل رسم خريطة كثافة الذروة القصوى لنطاق بصري خطي من BLACK (0٪) إلى لون (100٪) عن كل قسم في سلسلة التجارب (الشكل 3)، بدلا من رسم خرائط لجميع الفروع على نطاق ومطلق مشترك بنسبة 100٪ حيث هو كثافة الذروة القصوى من جميع أقسام (الشكل 5) . الأسلوب الأخير يسمح بمقارنة البيانات المجموعة وتصور من الاختلافات بين مجموعات العلاج.
يشكل عقبة رئيسية في تحليل IMS MALDI هو مهمة من الببتيدات إلى قمم كتلة محددة. على النسيج جنبا إلى جنب، قياس الطيف الكتلي الممكن في بعض الأحيان، ولكن غالبا ما يكون صعبا للغاية 13،14. فإننا نجد أنه يمكن استخدام نهج أكثر التقليدية بما في ذلك تجزئة إعدادي قوي على الكاتيون تبادل اللوني، تليها مرحلة LC-MS/MS معكوسة إلى نيوروببتيد تسلسل بنجاح العديد من الببتيدات الأفيونية خاصة. فإنه لا يزال من غير المألوف للحصول على نوعية جيدة MS / MS الأطياف التي لا تتطابق مع اي مداخلة على قاعدة البيانات باستخدام محركات البحث الشائعة مثل تعويذة. في هذه الحالات من جديد، من جهة تسلسل هو فقط. tواي خيار. يمكن الحصول على الدليل القاطع على هوية الذروة من قبل IMS MALDI من المقاطع النسيجية من الماوس خروج المغلوب المناسبة، ولكن هذه ليست دائما متاحة أو ممكنة. وبديل ذلك هو للتحقق من صحة النتائج وفقا لطريقة مختلفة تماما، على سبيل المثال بواسطة immunoblotting الغربي أو المناعية. وهذا يمكن أن تشمل في كثير من الأحيان رفع الأجسام المضادة، وقدرا كبيرا من العمل التحقق من الأجسام المضادة الجديدة.
تم تحسين الاستراتيجية العامة المقدمة في هذا البروتوكول على نطاق واسع للتجارب neuropeptide IMS MALDI بما في ذلك عدة أقسام والظروف التجريبية. وقد تم تحسين البروتوكول وخاصة بالنسبة للالببتيدات الأفيونية، وسيكون له أثر كبير في الدراسات المستقبلية، كما يعملون في مجالات متنوعة من الأبحاث بما في ذلك الآليات الكامنة وراء الألم والاستجابة الذاتية للعقاقير الإدمان.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر حنا وارنر للمساهمة بيانات الشكل (3) والأستاذ بيرجكويست جوناس للمساهمة قيمة. السويدية للمجلس البحوث (جرانت 522-2006-6416 (MA)، 521-2007-5407 (MA)، ومؤسسة Wiberg آك ل(ماجستير، JH)، والأكاديمية الملكية السويدية للعلوم (MA، JH)، والمواد الكيميائية السويدية والتقدير والإمتنان المجتمع (JH) للحصول على الدعم المالي.
Materials
1.1 Sample collection and preparation
- Isoflurane (Apoteksbolaget AB, Sweden)
- Surgical tools; two pairs of scissors, a rongeur, spatula
- Finely crushed dry ice
- Aluminum foil and plastic bags for storage
- Cryostat(Microm, Heidelberg, Germany)
- Indium−tin oxide (ITO)-coated MALDI slides (Bruker Daltonics, Germany)
- optimal cutting temperature medium (OCT) (Sakura Finetek Europe, Netherlands)
- vacuum dessicator
1.2 Matrix application
- Acetonitrile (ACN), methanol (MeOH), ethanol (EtOH) of pro-analysis grade (Merck, Germany).
- Trifluoroacetic acid (TFA) (Sigma Aldrich, St. Louis, MO).
- Water was purified with a Milli-Q purification system (Millipore, Bedford, MA).
- CHIP-1000 (Shimadzu, Japan) or Portrait 630 spotter (LabCyte, Sunnyvale, CA)
1.3 Mass spectrometry
- Ultraflex II (Bruker Daltonics)
- FlexImaging software (v 2.0, Bruker Daltonics)
- Peptide or Protein Calibration Standard (Bruker Daltonics)
1.4 Data processing
- Origin v.8.1 (OriginLab Corp, Norhampton, MA)
- Matlab version 7.9.0.529 (MathWorks, Natick, MA)
- pBin (http://www.vicc.org/biostatistics/software.php)
1.5 Neuropeptide identification
- Ultrasound sonicator
- 10 kDa molecular weight cut-off filter (Millipore, Bedford, MA)
- SP Sephadex C 25 gel (Sigma, Germany)
- Hypersil column (ThermoFisher)
- Pyridine, formic acid (FA), Acetonitrile (ACN), methanol (MeOH), ethanol (EtOH) of pro-analysis grade (Merck, Germany).
- Trifluoroacetic acid (TFA) Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA).
- Agilent 1100 nanoflow LC, microWPS, C18 column (0.075x150mm)
- Agilent 1100 Micro-fractioncollector, Prespotted anchorchip target plate (Bruker Daltonics)
- BioTools software (v 3.1 SR2, Bruker Daltonics)
- Bio Works software (v.3.3, Thermo Fisher; www.thermoscientific.com )
- Mascot software (v 2.2, MatrixScience; www.matrixscience.com )
- Swepep database (www.swepep.org)
References
- Obeso, J. A., Olanow, C. W., Nutt, J. G. Levodopa motor complications in Parkinson’s disease. Trends Neurosci. 23, S2-S7 (2000).
- Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular imaging of biological samples: localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS. MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).
- Obeso, J. A. The evolution and origin of motor complications in Parkinson’s disease. Neurology. 55, S13-S20 (2000).
- O, W. H. Noncommunicable Diseases and Mental Health Cluster, Noncommunicable Disease Prevention and Health Promotion Department, Ageing and Life Course. Active Ageing: A Policy framework. , (2002).
- Schapira, A. H. Movement disorders: advances in cause and treatment. Lancet Neurology. , 6-7 (2010).
- Obeso, J. A., Rodriguez-Oroz, M. C., Rodriguez, M., DeLong, M. R., Olanow, C. W. Pathophysiology of levodopa-induced dyskinesias in Parkinson’s disease: problems with the current model. Ann. Neurol. 47, S22-S32 (2000).
- Cenci, M. A., Lee, C. S., Bjorklund, A. L-DOPA-induced dyskinesia in the rat is associated with striatal overexpression of prodynorphin- and glutamic acid decarboxylase mRNA. Eur. J. Neurosci. 10, 2694-2706 (1998).
- Andersson, M., Hilbertson, A., Cenci, M. A. Striatal fosB expression is causally linked with l-DOPA-induced abnormal involuntary movements and the associated upregulation of striatal prodynorphin mRNA in a rat model of Parkinson’s disease. Neurobiol Dis. 6, 461-474 (1999).
- Hanrieder, J. Alterations of striatal neuropeptides revealed by imaging mass spectrometry. Molecular & Cellular Proteomics. , (2011).
- Cornett, D. S., Reyzer, M. L., Chaurand, P., Caprioli, R. M. MALDI imaging mass spectrometry: molecular snapshots of biochemical systems. Nat. Methods. 4, 828-833 (2007).
- Ljungdahl, Imaging Mass Spectrometry Reveals Elevated Nigral Levels of Dynorphin Neuropeptides in L-DOPA-Induced Dyskinesia in Rat Model of Parkinson’s Disease. PLoS ONE. 6, e25653 (2011).
- Groseclose, M. R., Andersson, M., Hardesty, W. M., Caprioli, R. M. Identification of proteins directly from tissue: in situ tryptic digestions coupled with imaging mass spectrometry. J. Mass. Spectrom. 42, 254-262 (2007).
- Andersson, M., Groseclose, M. R., Deutch, A. Y., Caprioli, R. M. Imaging mass spectrometry of proteins and peptides: 3D volume reconstruction. Nat. Methods. 5, 101-108 (2008).
- Deininger, S. -. O., Setou, M. . Imaging Mass Spectrometry. , 199-208 (2010).
- Norris, J. L. Processing MALDI Mass Spectra to Improve Mass Spectral Direct Tissue Analysis. Int. J. Mass. Spectrom. 260, 212-221 (2007).
- Ihaka, R., Gentleman, R. R. A Language for Data Analysis and Graphics. Journal of Computational and Graphical Statistics. 5, 299-314 (1996).
- Tusher, V. G., Tibshirani, R., Chu, G. Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 5116-5121 (2001).
- Bergstrom, L., Christensson, I., Folkesson, R., Stenstrom, B., Terenius, L. An ion exchange chromatography and radioimmunoassay procedure for measuring opioid peptides and substance P. Life. Sci. 33, 1613-1619 (1983).
- Falth, M. Neuropeptidomics strategies for specific and sensitive identification of endogenous peptides. Mol. Cell. Proteomics. 6, 1188-1197 (2007).
- Falth, M. SwePep, a database designed for endogenous peptides and mass spectrometry. Mol. Cell. Proteomics. 5, 998-1005 (2006).
