Revealing Neurale Circuit Topografie in Multi-Color
Summary
Wij bieden een praktische gids voor het leveren van tracers<em> In vivo</em> En gebruik de spinocerebellaire route als modelsysteem om essentiële stappen voor een succesvolle neuronale circuit analyse bij muizen aan te tonen. We beschrijven in detail onze veelzijdige tracing-protocol, dat tarwekiem agglutinine (WGA) geconjugeerd aan Alexa fluoroforen exploits.
Abstract
Neurale circuits worden georganiseerd in functionele topografische kaarten. Om de complexe schakeling architectuur te visualiseren we een aanpak ontwikkeld om op betrouwbare wijze het etiket van de wereldwijde patronen van meerdere topografische projecties. Het cerebellum is een ideaal model om de ordelijke rangschikking van neurale circuits te bestuderen. Zo heeft de organisatie van de compartimenteel spinocerebellaire bemoste vezels bewezen een onmisbaar systeem voor het bestuderen van bemoste vezels patronen worden. We hebben onlangs aangetoond dat tarwekiem agglutinine (WGA) geconjugeerd aan Alexa 555 en 488 kan worden gebruikt voor het opsporen van spinocerebellaire bemoste vezels projecties in het ontwikkelen en volwassen muizen (Reeber et al.. 2011). We vonden drie belangrijke eigenschappen die de WGA-Alexa tracers wenselijk tools te maken voor de etikettering neurale projecties. De eerste, Alexa fluoroforen zijn intens en de helderheid zorgt voor wholemount imaging direct na tracing. Ten tweede, WGA-Alexa tracers label het gehele traject van het ontwikkelen en volwassen neurale projections. Derde, WGA-Alexa tracers snel vervoerd in zowel de retrograde en anterograde richtingen. Hier beschrijven we in detail hoe de tracers en andere benodigde gereedschappen, hoe u de chirurgie voor spinocerebellaire tracing presteren en de beste manier om de afbeelding getraceerd projecties in drie dimensies te bereiden. Kortom, we bieden een stap-voor-stap tracing protocol dat nuttig zal zijn voor het ontcijferen van de organisatie en de connectiviteit van de functionele kaarten niet alleen in de kleine hersenen, maar ook in de cortex, de hersenstam en het ruggenmerg.
Protocol
Discussion
We hebben de chirurgische en technische details die nodig zijn voor een succesvolle axonale en dendriet traceren met behulp van een nieuwe tl-gebaseerde aanpak voor snel etikettering van neurale projecties in het ontwikkelen en volwassen muizen. Met behulp van WGA-Alexa laten we zien hoe tracers en markers kan gebruikt worden voor het analyseren van patronen circuit topografie met een hoge resolutie en in drie dimensies.
Veel tracers zijn beschikbaar voor het traceren van neuronale circuits …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de nieuwe onderzoeker start-up gelden van Albert Einstein College of Medicine van de Yeshiva University aan RVS.
Materials
| Equipment/Reagents | Model/Catalogue number | Company |
| Bead sterilizer | Model Steri 250 Cat. # 18000-45 | Fine Science Tools |
| Cauterizer | Cat. # 18000-00 | Fine Science Tools |
| Borosilicate glass capillaries | Cat. # 300056 | Harvard Apparatus |
| Dual stage Glass Micropipette Puller | Model 001-PC-10 | Narishige |
| Micrometer syringe | Cat. # GS-1100 | Gilmont Instruments |
| Small Animal Stereotaxic Instrument | Model 940-A | Kopf Instrumentation |
| Electrode Manipulator | Model 960 | Kopf Instrumentation |
| Vetcare chamber | Cat. # 340508 | Harvard Apparatus |
| Heating Pad | Cat. # 341241 | Harvard Apparatus |
| Leica DFC360 FX camera | DFC360 FX | Leica |
| Leica DFC490 camera | DFC490 | Leica |
| Leica DM5500 microscope | DM5500 | Leica |
| Leica DFC3000 FX camera | DFC3000 FX | Leica |
| Leica MZ16 FA microscope | MZ16 FA | Leica |
| CY3 Filter | Model # 11600231 | Leica |
| FITC Filter | Model # 11513880 | Leica |
| A4 DAPI/UV filter | Model # 11504162 | Leica |
| Wheat germ agglutinin, Alexa Fluor 488 conjugate | Cat. #W11261 | Invitrogen |
| Wheat germ agglutinin, Alexa Fluor 555 conjugate | Cat. #W32464 | Invitrogen |
References
- Apps, R., Hawkes, R. Cerebellar cortical organization: a one-map hypothesis. Nat. Rev. Neurosci. 10, 670-681 (2009).
- Grishkat, H. L., Eisenman, L. M. Development of the spinocerebellar projection in the prenatal mouse. J. Comp. Neurol. 363, 93-108 (1995).
- Mesulam, M. . Tracing neural connections with horseradish peroxidase. , (1982).
- Reeber, S. L., Sillitoe, R. V. Patterned expression of a cocaine- and amphetamine regulated transcript (CART) peptide reveals complex circuit topography in the rodent cerebellar cortex. Journal of Comparative Neurology. , (2011).
- Reeber, S. L., Gebre, S. A., Sillitoe, R. V. Fluorescence mapping of afferent topography in three dimensions. Brain. Struct. Funct. , (2011).
- Sillitoe, R. V., Stephen, D., Lao, Z., Joyner, A. L. Engrailed homeobox genes determine the organization of Purkinje cell sagittal stripe gene expression in the adult cerebellum. J. Neurosci. 28, 12150-12162 (2008).
- Sillitoe, R. V., Vogel, M. W., Joyner, A. L. Engrailed homeobox genes regulate establishment of the cerebellar afferent circuit map. J. Neurosci. 30, 10015-10024 (2010).
- Vig, J., Goldowitz, D., Steindler, D. A., Eisenman, L. M. Compartmentation of the reeler cerebellum: segregation and overlap of spinocerebellar and secondary vestibulocerebellar fibers and their target cells. Neuroscience. 130, 735-744 (2005).
- Vogel, M. W., Prittie, J. Topographic spinocerebellar mossy fiber projections are maintained in the lurcher mutant. J. Comp. Neurol. 343, 341-351 (1994).
- Voogd, J., Broere, G., van Rossum, J. The medio-lateral distribution of the spinocerebellar projection in the anterior lobe and the simple lobule in the cat and a comparison with some other afferent fibre systems. Psychiatr. Neurol. Neurochir. 72, 137-151 (1969).
- Wu, H. S., Sugihara, I., Shinoda, Y. Projection patterns of single mossy fibers originating from the lateral reticular nucleus in the rat cerebellar cortex and nuclei. J. Comp. Neurol. 411, 97-118 (1999).
