Revelando Topografia Circuito Neural em Multi-Color
Summary
Nós fornecemos um guia prático para entregar traçadores<em> In vivo</em> E usar a via espinocerebelar como um sistema modelo para demonstrar passos essenciais para a análise do circuito neuronal sucesso em camundongos. Descrevemos em detalhe o nosso protocolo versátil rastreamento que explora aglutinina de gérmen de trigo (WGA), conjugada com fluoróforos Alexa.
Abstract
Circuitos neurais funcionais estão organizados em mapas topográficos. Para visualizar a arquitetura circuito complexo que nós desenvolvemos uma abordagem para a fiabilidade rótulo o padrão global de múltiplas projeções topográficos. O cerebelo é um modelo ideal para estudar o arranjo ordenado dos circuitos neurais. Por exemplo, a organização compartimental de espinocerebelar fibras musgosas provou ser um sistema indispensável para o estudo de padronização de fibras musgosas. Recentemente, mostrou que aglutinina de gérmen de trigo (WGA), conjugada com Alexa 555 e 488 podem ser usados para rastreamento espinocerebelar projeções de fibras musgosas no desenvolvimento e camundongos adultos (Reeber et al. 2011). Encontramos três principais propriedades que tornam as ferramentas WGA-Alexa traçadores desejável para rotulagem projeções neural. Primeiro, fluoróforos Alexa são intensas e seu brilho permite imagens wholemount diretamente após rastreamento. Segundo, WGA-Alexa traçadores rótulo toda a trajetória de desenvolvimento neural e adultos Projections. Terceiro, WGA-Alexa traçadores são rapidamente transportados nas direções retrógrada e anterógrada. Aqui, descrevemos em detalhes como preparar os marcadores e outras ferramentas necessárias, como executar a cirurgia para rastreamento espinocerebelar ea melhor forma de projeções de imagem traçada em três dimensões. Em resumo, nós fornecemos um protocolo passo a passo de rastreamento que vai ser útil para decifrar a organização e conectividade de mapas funcionais não só no cerebelo, mas também no córtex, tronco cerebral e medula espinhal.
Protocol
Discussion
Nós descrevemos os detalhes cirúrgicos e técnicos necessários para o sucesso rastreamento axonal e dendrite usando uma abordagem baseada em romance fluorescentes para rapidamente rotulagem projeções neurais no desenvolvimento e camundongos adultos. Utilizando-WGA Alexa mostramos como traçadores e marcadores podem ser usados para analisar padrões topografia de circuito em alta resolução e em três dimensões.
Traçadores muitos estão disponíveis para rastrear circuitos neuro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo investigador novas start-up fundos de Albert Einstein College of Medicine da Yeshiva University de RVS.
Materials
| Equipment/Reagents | Model/Catalogue number | Company |
| Bead sterilizer | Model Steri 250 Cat. # 18000-45 | Fine Science Tools |
| Cauterizer | Cat. # 18000-00 | Fine Science Tools |
| Borosilicate glass capillaries | Cat. # 300056 | Harvard Apparatus |
| Dual stage Glass Micropipette Puller | Model 001-PC-10 | Narishige |
| Micrometer syringe | Cat. # GS-1100 | Gilmont Instruments |
| Small Animal Stereotaxic Instrument | Model 940-A | Kopf Instrumentation |
| Electrode Manipulator | Model 960 | Kopf Instrumentation |
| Vetcare chamber | Cat. # 340508 | Harvard Apparatus |
| Heating Pad | Cat. # 341241 | Harvard Apparatus |
| Leica DFC360 FX camera | DFC360 FX | Leica |
| Leica DFC490 camera | DFC490 | Leica |
| Leica DM5500 microscope | DM5500 | Leica |
| Leica DFC3000 FX camera | DFC3000 FX | Leica |
| Leica MZ16 FA microscope | MZ16 FA | Leica |
| CY3 Filter | Model # 11600231 | Leica |
| FITC Filter | Model # 11513880 | Leica |
| A4 DAPI/UV filter | Model # 11504162 | Leica |
| Wheat germ agglutinin, Alexa Fluor 488 conjugate | Cat. #W11261 | Invitrogen |
| Wheat germ agglutinin, Alexa Fluor 555 conjugate | Cat. #W32464 | Invitrogen |
References
- Apps, R., Hawkes, R. Cerebellar cortical organization: a one-map hypothesis. Nat. Rev. Neurosci. 10, 670-681 (2009).
- Grishkat, H. L., Eisenman, L. M. Development of the spinocerebellar projection in the prenatal mouse. J. Comp. Neurol. 363, 93-108 (1995).
- Mesulam, M. . Tracing neural connections with horseradish peroxidase. , (1982).
- Reeber, S. L., Sillitoe, R. V. Patterned expression of a cocaine- and amphetamine regulated transcript (CART) peptide reveals complex circuit topography in the rodent cerebellar cortex. Journal of Comparative Neurology. , (2011).
- Reeber, S. L., Gebre, S. A., Sillitoe, R. V. Fluorescence mapping of afferent topography in three dimensions. Brain. Struct. Funct. , (2011).
- Sillitoe, R. V., Stephen, D., Lao, Z., Joyner, A. L. Engrailed homeobox genes determine the organization of Purkinje cell sagittal stripe gene expression in the adult cerebellum. J. Neurosci. 28, 12150-12162 (2008).
- Sillitoe, R. V., Vogel, M. W., Joyner, A. L. Engrailed homeobox genes regulate establishment of the cerebellar afferent circuit map. J. Neurosci. 30, 10015-10024 (2010).
- Vig, J., Goldowitz, D., Steindler, D. A., Eisenman, L. M. Compartmentation of the reeler cerebellum: segregation and overlap of spinocerebellar and secondary vestibulocerebellar fibers and their target cells. Neuroscience. 130, 735-744 (2005).
- Vogel, M. W., Prittie, J. Topographic spinocerebellar mossy fiber projections are maintained in the lurcher mutant. J. Comp. Neurol. 343, 341-351 (1994).
- Voogd, J., Broere, G., van Rossum, J. The medio-lateral distribution of the spinocerebellar projection in the anterior lobe and the simple lobule in the cat and a comparison with some other afferent fibre systems. Psychiatr. Neurol. Neurochir. 72, 137-151 (1969).
- Wu, H. S., Sugihara, I., Shinoda, Y. Projection patterns of single mossy fibers originating from the lateral reticular nucleus in the rat cerebellar cortex and nuclei. J. Comp. Neurol. 411, 97-118 (1999).
