Identifizierung von Zielen für Menschenrechte microRNAs mit dem LightSwitch Luciferase Assay System mit 3'UTR-Reporter-Konstrukte und eine microRNA Mimic in adhärenter Zellen

Einführung MicroRNAs wurden als wichtige Regulatoren der Genexpression, die die Aktivität von vielen wichtigen biologischen Prozessen modulieren entstanden. Mit mehr als 700 Menschen miRNAs bisher 1 identifiziert, ist es nicht verwunderlich, dass Mutationen und unsachgemäße Regulierung von miRNAs auf eine Vielzahl von physiologischen Störungen wie Krebs und Herzerkrankungen 2,3 verbunden worden sind. Jüngste Studien haben gezeigt, dass die Mehrheit der miRNA regulatorischen Bindungsstellen in 3'UTRs 4,5 gefunden werden, und einige Forscher haben geschätzt, dass es Hunderte von Zielen pro miRNA in der Zelle 6. Angesichts der biologischen Bedeutung von miRNAs, die große Zahl von miRNAs, die es gibt und die große Anzahl von Zielen für jeden von ihnen, ist es entscheidend, dass die Forscher in der Lage, zuverlässig zu identifizieren endogenen Ziele von miRNAs, vorzugsweise auf Plattformen zugänglich High-Throughput-Studien sind. Unter Ausnutzung Computational Tools wie miRBase, TargetScan und PicTar 1,6,7 ist eine leistungsstarke Möglichkeit, Listen von vermeintlichen mRNA Ziele für jede miRNA zu generieren, sind die Vorhersagen noch nicht genau genug, um auf allein 8 herangezogen werden. Deshalb haben die Forscher auch nutzen eine Reihe von experimentellen Ansätzen, um Ziele de novo zu identifizieren oder prognostizierten Ziele zu überprüfen. Viele Teams haben sich auf High-Throughput-Maßnahmen der steady-state mRNA oder Protein-Ebene verlassen, um Gene für die Expression ändert sich, wenn miRNA-Aktivität gestört wird 4,9,10 identifizieren. Solche Veränderungen sind zweifellos biologisch sinnvoll und stellen einen wichtigen ersten Schritt, aber die Messung von Veränderungen in insgesamt Ausdruck nicht zwischen direkten Auswirkungen einer miRNA unterscheiden auf ein Transkript und indirekte oder nachgeschalteten Signalwirkung. Weitere leistungsstarke Werkzeuge, die Beweise für unmittelbare miRNA-mRNA Interaktionen sind Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) Strategien, die Cross-Link-Argonaut-Proteine ​​(und damit die RISC-Komplex), um miRNAs und mRNAs, wenn die Identifizierung der Interaktionspartner nicht sofort zeigen die funktionellen Auswirkungen eine solche Bindung bei 5,11. So haben 3'UTR-Reporter-Assays, die funktionelle Beweise für eine miRNA-Effekt auf einen bestimmten UTR bieten zu einem wichtigen Bestandteil einer gründlichen miRNA-Studie. Solche Zell-basierte Assays Daten zusammen mit Computational Ziel Vorhersagen oder Ausdruck und Proteomik-Daten übernommen bietet starke Beweise dafür, dass eine bestimmte 3'UTR direkt durch die miRNA von Interesse geregelt. In einem 3'UTR-Reporter-Assay ist der 3'UTR von einem Gen von Interesse, um das Ende eines Luciferase-Reportergen fusioniert. Wenn die 3'UTR ist ein Ziel von miRNA wird der Reporter-Transkript Stabilität und / oder ihre Übersetzung Effizienz mit einer Variation in der funktionellen miRNA-Konzentration ändern. So anders als Transkript-only basierte Assays, helfen Reporter-Assays identifizieren Wirkungen sowohl auf die steady state mRNA und Protein-Ebene. Reporter-Systeme können auch verwendet werden, um die funktionalen Auswirkungen der Mutagenese einer vermeintlichen miRNA-Bindestelle in einer 3'UTR zu bestätigen, dass es erforderlich ist, für die interaction8 studieren. Und während groß angelegte Studien mit Expressions-Arrays, Proteomik Techniken und Argonaut ChIP wertvolle genomweite Daten für eine kleine Anzahl von experimentellen Bedingungen, zellbasierte Reporter-Assays liefern, sind die meisten zugänglich Scaling-up für das Studium der miRNA-3 ' UTR Interaktionen in Hunderte oder Tausende von Bedingungen, wie könnte es für das Hochdurchsatz-Screening von kleinen Molekülen oder andere Bibliothek-basierte Effektoren notwendig. Viele Wissenschaftler haben Reporter-Assay-Technologie, um die Untersuchung von miRNA-3'UTR Wechselwirkungen angewendet. Doch mit der Idee, dass viele miRNAs jedes Ziel Hunderte von verschiedenen Abschriften, es wurde für die Forscher schwierig, diese leistungsfähigen Ansatz auf einem High-Throughput-Skala verwenden, da das Klonen, Validierung und Optimierung Schritte zum Erstellen Tausende von verschiedenen 3'UTR- Reporter Vektoren sind oft kostspielig. In dem Bemühen, kleine und große 3'UTR-Reporter Studien zugänglich zu jedem Forscher zu machen, haben wir eine genomweite Sammlung menschlicher 3'UTRs in die hoch-optimierte LightSwitch Luciferase Assay System vor geklonten erstellt. Der Reporter-System beinhaltet auch validierten Vektoren, einen Satz von mehr als 700 synthetische miRNA Ziel-Reporter-Konstrukte für die Verwendung als positive Kontrollen, sowie eine Reihe von standardisierten experimentellen Protokolle. Mit dem folgenden Protokoll, können Sie fragen, ob ein bestimmtes menschliches 3'UTR ein Ziel Ihrer miRNA von Interesse ist. Die entscheidenden Schritte in diesem Workflow werden experimentelle Design, die Transfektion von Reporter-Konstrukte und miRNA imitiert, Luciferase-Reporter-Assays und Datenanalyse. Für die experimentelle Design, ist es wichtig, nachdenklich wählen Sie eine transfizierbare Zelllinie, Experimental-und Kontrollgruppe Reporter-Konstrukte, und miRNA imitiert und nicht-Targeting-Kontrollen. Gemeinsame hoch transfizierbare adhErent Zelllinien wie HT1080, HepG2, HCT-116, Hela, 293, und andere, oft gut mit diesem Protokoll. Wichtige Hinweise zum experimentellen Design Die LightSwitch Luciferase Assay System ist ein voll optimiertes Reporter-System, das GoClone Konstrukte unter Verwendung der RenSP Luciferase-Gen und LightSwitch Luciferase Assay Reagenzien enthält. Verwenden Sie alle Komponenten des LightSwitch System als empfohlen, um eine optimale Reporter-Assay Ergebnisse zu erhalten. Co-Transfektion von Oligos / Plasmide mit Schaltanlagen GoClone Reporter-Konstrukte reduziert insgesamt Luciferase-Signale in einem nicht-spezifischen Art und Weise. Deshalb ist es wichtig, die nach der Transfektion Kombinationen ausführen: Reporter nur, Reporter + non-targeting Kontrolle miRNA und Reporter + spezifische miRNA. Unsere empty_3UTR Vektor (starken Promotor, keine UTR) bietet eine sehr hohe Luciferase-Signal und dient als positive Kontrolle für die Transfektionseffizienz und eine synthetische miRNA Ziel-Reporter Vektor kann als positive Kontrolle für mimische Aktivität dienen. Darüber hinaus empfehlen wir die Verwendung des GoClone 3'UTR Hauswirtschaft Kontrollen und stichprobenartige Kontrollen für die präzise Trennung von Sequenz-spezifische vs unspezifische Effekte. Study Ihr Protokoll und wann immer möglich zu machen Mastermixen, um die Variabilität in Ihrer Daten durch Pipettieren Fehler oder Verdunstung zu verringern. Dieses Protokoll verwendet DharmaFect Duo Transfektionsreagenz (Dharmacon). Tag 1 Wichtiger Tipp: Wählen Sie Ihre Zelllinie mit Bedacht aus. Für die besten Ergebnisse erzielen Sie mit einer Zelllinie, die bekanntermaßen transfizierbare ist. Wir haben auch festgestellt, dass die messbare Reaktion eines 3 'UTR-Reporter zu einem miRNA imitieren gedämpft wird in Zell-Linien mit hohen endogenen, dass insbesondere miRNA. Wenn Sie nicht wissen, wie viel Ihr Zellinie exprimiert miRNA, versuchen SGG ist synthetische microRNA Ziel, die indirekt misst die Häufigkeit eines bestimmten miRNA in einer Zelle als auch darüber informiert, wie der dynamische Bereich des Assays. 1. Seed-Zellen zu ≥ 80% Konfluenz zum Zeitpunkt der Transfektion zu erhalten. Seed-Zellen in einer 96-well weißen TC Platte in 100 &mgr; l Gesamtvolumen. In parallel, Saatgut der entsprechenden Anzahl von Zellen in einer klaren 96-Well-Platte für die Beurteilung der Mündung. WICHTIGER TIPP 1: Confluence ist der Schlüssel zu guten Ergebnissen in einer mimischen Experiment. Für eine optimale Zuschlag sollten die Zellen zu 100% konfluent zum Zeitpunkt der Transfektion werden. WICHTIGER TIPP 2: Verwenden niedrigen Durchgang Zellen für die besten Ergebnisse. Zellen, die zu oft haben passagiert eher lauten Transfektion Daten zu erhalten. Tag 2 Bereiten GoClonereporter Konstrukte und miRNAs, dann in die konfluenten Zellen zu transfizieren. 2. Bereiten Konstrukte Thaw GoClone Konstrukte (Plasmid-DNA) bei Raumtemperatur. Gut mischen. Zentrifuge, um Kondensation von der Kappe entfernen. 3. Bereiten Micro RNAs Thaw microRNAs (spezifische Mimik und non-targeting-Kontrollen) bei Raumtemperatur und zentrifugieren, um Kondensation von den Kappen zu entfernen. Verdünnen, um eine funktionierende Konzentration von 2 nM in RNase-freiem Wasser. Zusätzlich zu einer experimentellen miRNA imitieren immer ein non-targeting miRNA-Steuerung. Co-Transfektion ein Plasmid und ein kleines RNA-Oligo führt zu geringeren Signal als Transfektion der Plasmid allein. Fügen Sie einen oder mehrere positive Kontrollen. Erwägen Sie die Verwendung einer der Hunderten von synthetischen miRNA Ziel-Reporter-Vektoren in SGG-Katalog. Fügen Sie eine oder mehrere negative oder unspezifische Kontrollen. SGG hat eine Reihe von Kontrollen einschließlich 3 'UTRs von Housekeeping-Genen, zufällige Fragmente und / oder die leere (kein UTR insert) zu kontrollieren. Die Verwendung von einem oder mehreren dieser Kontrollen neben einem experimentellen Aufbau ermöglicht es Ihnen, für alle nicht-spezifische Effekte auf die Überexpression von Ihren spezifischen miRNA oder die Nicht-Targeting Kontrolle zu normalisieren. 4. Bereiten Transfektionen Für jede Transfektion kombinieren die folgenden Reagenzien für einen einzigen Test: Mischung 1 Individuelle GoClone Reporter: 3,33 ul microRNA: Variiert * Serum-freien Medien: bis 10 ul * Effektive Konzentration der miRNA kann von 10 nM-100 nM variieren. Consult miRNA Hersteller für entsprechende Konzentration. Wichtiger Tipp: Fügen Sie nicht zu viel zu imitieren. Ein vernünftiger Bereich für imitieren Konzentrationen 10-50 nm in den letzten 100 ul Reaktion. Führen Sie mindestens drei Replikate Transfektionen für jede Behandlung / UTR Kombination und zusätzliche Volumen für das Pipettieren Fehler erlauben. Zum Beispiel, multiplizieren Sie die einzelnen Reaktionsvolumina von 3,5 bis genug Transfektion Mix für 3 replizieren Transfektion Brunnen inklusive Verlängerung zum Pipettieren Fehler oder Verdunstung zu bekommen. Für jeden Reporter, Einrichten Wiederholungen für die folgenden: Reporter nur, Reporter + non-targeting Kontrolle miRNA und Reporter + spezifische miRNA. Set up Transfektionen für das Targeting microRNA zur gleichen Zeit wie die für eine nicht-Targeting zu kontrollieren. Make up der DharmaFECT DUO (Dharmacon)-Gemisch wie folgt für jede Transfektion: Mischung 2 DharmaFect Duo: 0,15 ul Serum freie Medien: 9,85 ul Die Höhe der DharmaFECT Duo hinzugefügt werden kann Zelllinie abhängig sein. Die oben angegebenen Mengen sind für HT1080-Zellen. Wenden Sie sich an die Dokumentation des Herstellers, um den entsprechenden Betrag für Ihre Zelllinie zu bestimmen. Tipp: Machen Sie einen großen Transfektion Mischung durch Multiplikation der Mengen von mehr als durch die Zahl der Journalisten, repliziert die Anzahl und die Anzahl der miRNAs getestet werden. Bei der Berechnung der Höhe der Transfektion Mix zu erstellen, sollten Sie eine kleine Menge extra für Pipettierfehler und Verdunstung Konto gehören. Lassen Sie die DharmaFECT Duo Mischung bei Raumtemperatur für 5 Minuten inkubieren. Nach 5 Minuten, fügen Sie 10 &mgr; l der DharmaFECT Duo-Gemisch (Gemisch 2) für jeden vorbereitet Rohr 10uL Plasmid-und / oder miRNA (Gemisch 1). Jedes Rohr sollte dann enthalten ein Volumen von 20 &mgr; l pro Wiederholung Transfektion. Inkubieren jeder Mischung für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Nach 20 Minuten, fügen Sie 80 ul vorgewärmtes (37 ° C), Antibiotika-freien, vollständigen Medien je Wiederholung in jedes Röhrchen für eine Gesamtmenge von 100 &mgr; l pro Wiederholung Transfektion. Ein Deep-Well-Block kann für die Herstellung von vielen Wiederholungen und Proben gleichzeitig verwendet werden. Mischen Sie die Lösung durch Auf-und Abpipettieren. Entfernen Sie die gesetzte Platte aus dem Inkubator. Stellen Sie sicher, dass die Zellen mindestens 80% konfluent sind. Sorgfältig Pipette aus den Medien von jeder Vertiefung. Add 100 &mgr; der Transfektion Gemisch (20 ul DNA / Reagenzienmix + 80uL Medien) in jede Vertiefung. Legen Sie Platte in Inkubator über Nacht. Nicht zu bebrüten. Die meisten imitiert wird zu signifikanten Ergebnisse auf bona fide Ziele innerhalb von 24 Stunden. Das Niveau der Repression messbare nach 48 Stunden kann größer sein, aber so wird das auch gut Variabilität. Mimic Experimente sind einfacher als Inhibitor Experimente. Während die meisten imitiert deutlich unterdrücken wird wahr Ziele innerhalb von 24 Stunden, erhebliche de-Repression auf die Inhibitor kann 48 Stunden messbar sein und wird fast immer weniger ausgeprägt als die Wirkung des zu imitieren. Tag 3 Hinweis: Luciferase-Assays können sofort durchgeführt werden oder die Platten können bei -80 ° C eingefroren werden (Einfrieren der Regel erhöht Zelllyse und Luciferase-Signal). Einfrieren und Auftauen Ihre Zellen vor Testbeginn für beste Ergebnisse. REMEMBER auf gefrorenen Zellen auftauen auf Raumtemperatur lassen, bevor Sie LightSwitch Assay Reagent. 5. Messen Sie die Luciferaseaktivität mit LightSwitch AssayReagents Entfernen Platte von Inkubator und auf Raumtemperatur bringen. Bereiten LightSwitch Assay Reagenzien (für LS010-Kit, Protokolle von anderen Kit Größen können online gefunden werden): Rekonstituieren 100X Substrat durch Zugabe von 100 &mgr; l des Substrats Solvent zu Tube lyophilisiert Assaysubstrat. Vor Licht und möglichst wenig Zeit bei Raumtemperatur. 100X Substrat kann bei -20 ° C für 2-3 Wochen gelagert werden. Für die besten Ergebnisse erzielen Sie mit frisch wiederhergestellten Substrat. Bereiten Assay-Lösung durch Auftauen 10ml Flasche Assay-Puffer bei Raumtemperatur Wasserbad und fügen 100 &mgr; rekonstituierter 100X Substrat vor dem Gebrauch. Gut mischen. Verwenden Sie ein Multi-Kanal-Pipette auf 100 &mgr; LightSwitch Assay-Lösung (Puffer + Substrat) direkt zu jeder Probe gut (mit 100 ul Zellen + Medien) in einem weißen 96-Well-Platte hinzufügen. Wenn Zellen wurden in einer anderen Platte oder Kolben-Format übertragen Proben gewachsen um einen weißen 96-Well-Platte in 100 &mgr; l Gesamtvolumen (Medien oder PBS). Abdeckplatte, vor Licht zu schützen, und inkubieren für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Bei Testung mehr als eine Platte, taumeln Zugabe von Assay-Lösung, so dass jede Platte für 30 Minuten vor dem Lesen brütet. Lesen Sie jede gut für 2 Sekunden in eine Platte lumiLuminometer (SpectraMax L oder gleichwertig). Berechnen Sie den Zuschlag durch die Berechnung Luciferase-Signal-Verhältnis für jedes Konstrukt für spezifische miRNA über die nicht-Targeting-Steuerung (Lumineszenz = spezifische miRNA / non-targeting-Steuerung). Verwenden Sie die Daten aus Haushalt, zufällige und leere Konstrukte für Nicht-UTR spezifische Behandlung Effekte zu steuern. Repräsentative Ergebnisse 3'UTR Ziele in der Gegenwart eines Targeting-miRNA zeigen Luciferase Zuschlag. Der Knockdown von 3'UTR-Luciferase-Reporter-Aktivität durch let-7a wurde in HT1080-Zellen durch Co-Transfektion von 100 ng von jedem Reporter gemessen Konstrukt mit 20nm let-7a imitieren oder nicht-Targeting-Kontrolle, Inkubation für 24 Stunden, dann liest der Lumineszenz-Reporter Signal mit LightSwitch Luciferase Assay-Reagenzien. Abbildung 1. Punktiert und ARID3B menschlichen 3'UTRs sind die Ziele des let-7a microRNA. Signale von menschlichen 3'UTR-Reporter für die punktiert und ARID3B Gene sind deutlich in der Gegenwart des let-7a microRNA klopfte imitieren, während Signale für Hauswirtschaft und zufälliger Reihenfolge UTRs nicht.