L'identification des cibles de microARN humaine avec le système LightSwitch Luciferase Assay utilisant 3'UTR-reporter Construit et un microARN dans les cellules adhérentes Mimic

Présentation Les microARN sont apparues comme d'importants régulateurs de l'expression génique qui modulent l'activité de nombreux processus biologiques importants. Avec plus de 700 miARN humains identifiés jusqu'à présent 1, il n'est pas surprenant que les mutations et la régulation inappropriée de miARN ont été liés à une variété de désordres physiologiques tels que le cancer et les maladies cardiaques 2,3. Des études récentes ont montré que la majorité des miARN réglementaires des sites de liaison se trouvent dans 3'UTRs 4,5, et certains chercheurs ont estimé qu'il ya des centaines de cibles par miARN dans la cellule 6. Compte tenu de l'importance biologique des miARN, le grand nombre de miARN qui existent et le grand nombre d'objectifs pour chacun d'eux, il est essentiel que les chercheurs sont en mesure d'identifier de manière fiable les cibles endogènes des miARN, de préférence sur des plates-formes se prêtent à haut débit études. Tout en utilisant des outils informatiques tels que miRBase, TargetScan et PicTar 1,6,7 est un moyen puissant pour générer des listes de cibles ARNm putatifs pour toute miARN, les prédictions ne sont pas encore assez précises pour être fier seuls 8. Par conséquent, les chercheurs tirent également parti d'un certain nombre d'approches expérimentales pour identifier les cibles de novo ou de valider des cibles prévues. De nombreuses équipes se sont appuyés sur les mesures à haut débit des taux d'ARNm ou de protéines état ​​stationnaire pour identifier les gènes dont les variations d'expression lorsque l'activité est perturbée miARN 4,9,10. Ces changements sont sans doute biologiquement significative et représentent une première étape importante, mais la mesure des changements dans l'expression globale ne fait pas de distinction entre les effets directs d'un miARN sur une transcription et indirects ou en aval des effets de signalisation. Autres outils puissants qui fournissent des preuves directes pour les miARN-ARNm interactions sont chromatine immunoprécipitation (ChIP) les stratégies que les protéines Argonaute cross-link (et donc le complexe RISC) pour miARN et ARNm, bien identifier les partenaires d'interaction n'a pas immédiatement indiquer les effets fonctionnels d'un tel événement de liaison 5,11. Ainsi, 3'UTR-reporter tests fonctionnels qui fournissent des preuves pour un effet un miRNA sur un particulier UTR sont devenus une composante importante d'une étude approfondie miARN. Ces données d'analyse basée sur des cellules prises ensemble avec les prédictions cibles de calcul ou d'expression et des données de protéomique fournit des preuves solides qu'un 3'UTR particulier est directement réglementé par le miARN d'intérêt. Dans un essai 3'UTR-reporter, le 3'UTR d'un gène d'intérêt est fusionnée à la fin d'un gène rapporteur luciférase. Si le 3'UTR est une cible d'un miARN, la stabilité transcription journaliste et / ou son efficacité de traduction va changer avec variation de la concentration miARN fonctionnels. Donc, contrairement à la transcription seule base des dosages, les dosages journaliste aider à identifier les effets sur les deux ARNm état stable et des niveaux de protéines. Reporter systèmes peuvent également être utilisées pour étudier les effets fonctionnels de mutagenèse un site putatif de liaison miARN dans un 3'UTR de confirmer qu'il est effectivement nécessaire pour la interaction8. Et tandis études à grande échelle en utilisant des tableaux d'expression, les techniques de protéomique, et ChIP Argonaute fournir de précieux échelle du génome de données pour un petit nombre de conditions expérimentales, des tests basés sur les cellules journaliste sont les mieux adaptés à l'élargissement pour l'étude des miARN-3 ' interactions UTR dans des centaines ou des milliers de conditions que peut devenir nécessaire pour criblage à haut débit de petites molécules ou d'autres à base de bibliothèque effecteurs. De nombreux scientifiques ont appliqué la technologie de dosage de journaliste à l'étude des miARN-3'UTR interactions. Cependant, avec l'idée que de nombreux miARN chaque cible de centaines transcriptions différentes, il a été difficile pour les chercheurs à utiliser cette approche puissante sur une échelle de haut débit, car les étapes du clonage, de validation et d'optimisation pour créer des milliers de différentes 3'UTR- vecteurs rapporteurs sont souvent des coûts prohibitifs. Dans un effort pour faire de petites et grandes 3'UTR-reporter d'études accessibles à tout chercheur, nous avons créé une collection échelle du génome des humains 3'UTRs pré-cloné dans le système hautement optimisé LightSwitch Luciferase Assay. Le système rapporteur comprend également des vecteurs de contrôle validé, un ensemble de plus de 700 constructions de miARN synthétiques journaliste de cible pour l'utiliser comme contrôles positifs, et une série de protocoles expérimentaux standardisés. En utilisant le protocole suivant, vous pouvez demander si une 3'UTR humain particulier est une cible de votre miARN d'intérêt. Les étapes essentielles de ce flux de travail sont la conception expérimentale, la transfection des constructions rapporteurs et imite miARN, des dosages rapporteur de la luciférase, et l'analyse des données. Pour la conception expérimentale, il est important de sélectionner judicieusement une lignée cellulaire transfectables, constructions rapporteurs expérimentaux et de contrôle, et imite miARN et non-ciblage des contrôles. Commune très transfectables adhlignées cellulaires comme les érents HT1080, HepG2, HCT-116, Hela, 293, et autres ont souvent bien travailler avec ce protocole. Notes importantes sur la conception expérimentale Le système LightSwitch Luciferase Assay est un système rapporteur entièrement optimisé qui comprend des constructions GoClone utilisant le gène de la luciférase et RenSP Réactifs LightSwitch Luciferase Assay. Utilisez toutes les composantes du système LightSwitch tel que recommandé pour obtenir des résultats optimaux de dosage journaliste. La co-transfection des oligos / plasmides avec des constructions de commutation journaliste GoClone réduit l'ensemble des signaux luciférase de manière non-spécifique. Par conséquent, il est important d'effectuer les combinaisons de transfection suivantes: seul reporter, journaliste + miARN de contrôle non-ciblage, et le journaliste + miARN spécifiques. Notre vecteur empty_3UTR (promoteur fort, aucun UTR) offre un très haut niveau de signal de la luciférase et sert de contrôle positif pour l'efficacité de transfection, et un vecteur miARN synthétiques cibles journaliste peut servir de contrôle positif pour simuler l'activité. En outre, nous recommandons d'utiliser les contrôles GoClone ménage 3'UTR et de contrôles aléatoires pour séparer précisément séquence-spécifique vs des effets non spécifiques. Étude de votre protocole et si possible faire des master mix pour diminuer la variabilité dans vos données dues aux erreurs de pipetage ou l'évaporation. Ce protocole utilise réactifs de transfection DharmaFect Duo (Dharmacon). Jour 1 Conseil important: Choisissez votre lignée cellulaire à bon escient. Pour de meilleurs résultats, utilisez une lignée cellulaire qui est connu pour être transfectables. Nous avons également constaté que la réponse mesurable d'un journaliste 3 'UTR d'un miRNA synoptique est atténué dans des lignées cellulaires avec des niveaux élevés endogènes de ce miARN particulier. Si vous ne savez pas combien miARN votre ligne cellulaire exprime, essayez cibles SGG microARN synthétique qui mesure indirectement l'abondance d'un miARN particulier dans une cellule ainsi que vous informer que la plage dynamique de votre test. 1. Cellules pour produire des semences confluent ≥ 80% au moment de la transfection. Cellules des graines dans un 96-TC et plaque blanche au volume total 100 pi. En parallèle, les graines, le nombre approprié de cellules dans une plaque de 96 puits claires pour évaluer la confluence. ASTUCE IMPORTANTE 1: Confluence est la clé pour obtenir de bons résultats dans une expérience imiter. Pour knockdown optimale, les cellules doivent être à 100% confluentes au moment de la transfection. ASTUCE IMPORTANT 2: Utilisation des cellules passage bas pour obtenir les meilleurs résultats. Les cellules qui ont été repiquées trop de fois ont tendance à produire des données de transfection bruyant. Jour 2 Préparer des constructions et des miARN GoClonereporter, puis transfecter dans les cellules confluentes. 2. Préparer Construit Construit GoClone Thaw (ADN plasmidique) à température ambiante. Mélangez bien. Centrifugeuse pour enlever la condensation de la PAC. 3. Préparer ARN Micro MicroARN Thaw (imite spécifiques et non-ciblage des contrôles) à température ambiante et centrifuger pour enlever la condensation des chapeaux. Diluer à une concentration de travail de 2 uM dans l'eau sans RNase. En plus d'un miARN expérimentale imitent toujours inclure un contrôle de miARN non-ciblage. Co-transfection d'un plasmide et un petit ARN oligo entraîne une baisse du signal que la transfection du plasmide seul. Inclure un ou plusieurs contrôles positifs. Pensez à utiliser l'une des centaines de vecteurs synthétiques miARN journaliste de cible dans le catalogue de SGG. Inclure un ou plusieurs contrôles négatifs ou non spécifiques. SGG a une série de contrôles dont UTR 3 'de gènes de ménage, des fragments aléatoires et / ou le vide (pas d'insérer UTR) de contrôle. L'utilisation d'un ou plusieurs de ces contrôles aux côtés d'une construction expérimentale vous permettra de normaliser les effets non spécifiques liés à la surexpression de votre miRNA spécifique ou le contrôle non-ciblage. 4. Préparer transfections Pour chaque transfection combiner les réactifs suivants pour un dosage unique: Mélange 1 Individuels journaliste GoClone: 3,33 uL microARN: Variable * Milieux exempts de sérum: à 10 uL * Concentration efficace des miARN peut varier de 10 nM-100 nM. Consulter le fabricant pour les miARN concentration appropriée. Conseil important: Ne pas ajouter trop d'imiter. Une fourchette raisonnable pour imiter les concentrations est de 10 à 50 nM dans la réaction finale 100ul. Effectuer au moins trois répliquestransfections TE pour chaque traitement / combinaison UTR et comprennent un volume supplémentaire pour permettre de pipetage erreur. Par exemple, multiplier les volumes seule réaction par 3,5 pour obtenir mélange de transfection assez pour trois puits de transfection de reproduire, y compris un supplément pour le pipetage d'erreur ou d'évaporation. Pour chaque journaliste, mis en place se réplique dans les cas suivants: seul reporter, journaliste + miARN de contrôle non-cible et reporter + miARN spécifiques. Mettre en place des transfections pour les microARN ciblant à la fois identiques à celles d'un contrôle non-ciblage. Faire remonter la DharmaFECT DUO (Dharmacon) du mélange comme suit pour chaque transfection: Mélange 2 DharmaFect Duo: 0,15 uL Milieux exempts de sérum: 9,85 uL Le montant de DharmaFECT Duo à ajouter peut être une lignée cellulaire dépendante. Les montants indiqués ci-dessus sont appropriés pour des cellules HT1080. Consultez la documentation du fabricant pour déterminer le montant approprié pour votre lignée cellulaire. Astuce: Faites un mélange de transfection grands en multipliant les volumes ci-dessus par le nombre de journalistes, le nombre de répétitions et le nombre de miARN d'être testé. Lors du calcul de la quantité de mélange de transfection à préparer, être sûr d'inclure une petite quantité supplémentaire pour tenir compte des erreurs de pipetage et l'évaporation. Laisser le mélange Duo DharmaFECT à incuber à température ambiante pendant 5 minutes. Après 5 minutes, ajouter 10 ul du mélange Duo DharmaFECT (mélange 2) à chaque tube préparé des 10uL plasmide et / ou miARN (mélange 1). Chaque tube devrait alors contenir un volume de 20 pi par transfection répliquer. Incuber chaque mélange pendant 20 minutes à température ambiante. Après 20 minutes, ajouter 80 ul de pré-chauffée (37 ° C), sans antibiotique, milieu complet par répétition dans chaque tube pour un total de 100 ul par transfection répliquer. Un bloc de puits profonds peuvent être utilisés pour la préparation de beaucoup de répétitions et d'échantillons simultanément. Mélanger la solution par aspiration et refoulement. Retirer la plaque de tête de série de l'incubateur. Vérifiez que les cellules sont au moins 80% de confluence. Soigneusement pipette hors les médias de chaque puits. Ajouter 100 ul du mélange de transfection (20ul ADN / réactif mix + 80uL médias) à chaque puits. Placez la plaque dans l'incubateur pendant la nuit. Ne pas trop incuber. La plupart imite va produire des résultats significatifs sur bona fide des cibles dans les 24 heures. Le niveau de répression mesurable à 48 heures peut être plus grande, mais ce sera bien à la variabilité du bien. Mimic expériences sont plus faciles que les expériences inhibiteur. Alors que la plupart imite de manière significative réprimer les véritables cibles dans les 24 heures, d'importantes dé-répression attribuable à l'inhibiteur peut prendre 48 heures pour être mesurables et sera presque toujours moins prononcé que l'effet de l'imiter. Jour 3 Remarque: des tests luciférase peut être effectuée immédiatement ou les plaques peuvent être congelés à -80 ° C (congélation augmente généralement la lyse des cellules et le signal de la luciférase). Gel et dégel de vos cellules, avant doser pour obtenir les meilleurs résultats. N'oubliez pas de laisser décongeler les cellules gelées à la température ambiante avant d'ajouter réactif de dosage LightSwitch. 5. Mesurer l'activité luciférase avec AssayReagents LightSwitch Retirer la plaque de l'incubateur et amener à température ambiante. Préparer des réactifs de dosage LightSwitch (pour le kit LS010, les protocoles de tailles kit d'autres peuvent être trouvés en ligne): Substrat Reconstituer 100X en ajoutant 100 pi de substrat solvant au tube de substrat Assay lyophilisée. Protéger de la lumière et de minimiser le temps à température ambiante. Substrat 100X peuvent être conservés à-20C pour le 2-3 semaines. Pour de meilleurs résultats, utilisez substrat fraîchement reconstitué. Préparer la solution de dosage par la fonte bouteille de 10ml de tampon de dosage dans le bain d'eau à température ambiante et ajouter 100 ul de substrat 100X reconstitué avant utilisation. Mélangez bien. Utiliser une pipette multi-canaux à ajouter 100 ul de solution de dosage LightSwitch (tampon + substrat) directement à chaque échantillon (contenant 100 ul cellules + média) dans une assiette blanche de 96 puits. Si les cellules ont été cultivées dans un autre format de plaque ou flacon, le transfert des échantillons d'une plaque blanche de 96 puits dans le volume total 100 pi (médias ou PBS). Recouvrir la plaque, protéger de la lumière, et incuber pendant 30 minutes à température ambiante. Si titrant plus d'une plaque, étaler addition d'une solution de dosage afin que chaque assiette incube pendant 30 minutes avant la lecture. Lisez chaque puits pendant 2 secondes dans une plaque de Luminometer (SpectraMax L ou équivalent). Calculer le knockdown en calculant rapport signal luciférase pour chaque construction de miARN spécifiques pour le contrôle non-ciblage (= la luminescence miRNA spécifique / non-cible de contrôle). Utilisez les données de l'entretien ménager, au hasard, et les constructions vides à contrôler pour les non-UTR effets des traitements spécifiques. Les résultats représentatifs Cibles 3'UTR de la présence d'un miARN ciblant montrent knockdown luciférase. Le knockdown de l'activité du rapporteur 3'UTR-luciférase par let-7a a été mesurée dans des cellules HT1080 par co-transfection 100 ng de chaque journaliste de construire avec 20nm laissez-7a de contrôle imiter ou non-ciblage, 24 heures d'incubation, puis en lisant le journaliste luminescents signal de l'aide de réactifs LightSwitch Luciferase Assay. Figure 1. 3'UTRs ponctua et ARID3B humains sont des cibles de l'microARN let-7a. Signaux de journalistes 3'UTR humaines pour la ponctua et les gènes sont significativement ARID3B renversé dans la présence du microARN let-7a imitent alors que les signaux d'entretien ménager et séquence aléatoire UTR sont pas.