3'UTR muhabiri oluşturur ve bir microRNA kullanarak LightSwitch Lusiferaz Test Sistemi ile İnsan microRNA belirlenmesi Hedefler yapışık hücrelere Mimik

Giriş MicroRNA birçok önemli biyolojik süreçlerin aktivitesini düzenleyen gen ekspresyonu önemli bir düzenleyici olarak ortaya çıkmıştır. 700'den fazla insan miRNA'lar Şimdiye kadar 1 tanımlanan, mutasyonlar ve miRNA'lar yanlış düzenleme, kanser ve kalp hastalığı 2,3 gibi çeşitli fizyolojik bozukluklar ile bağlantılı olması şaşırtıcı değil. Son çalışmalar miRNA düzenleyici bağlayıcı sitelerin çoğunluğu 3'UTRs 4,5 olduğunu göstermiştir ve bazı araştırmacılar, yüzlerce hücre 6 miRNA başına hedefleri olduğunu tahmin etmektedir . MiRNA'lar biyolojik önemi göz önüne alındığında, çok sayıda var miRNA'lar ve bunların her biri için çok sayıda hedefler, araştırmacılar, güvenilir, tercihen yüksek verimli çalışmalar için uygun platformlarda miRNA'lar endojen hedefleri tespit etmek mümkün olduğu kritik öneme sahiptir. MiRBase, TargetScan ve PicTar 1,6,7 gibi hesaplama araçlarını kullanarak herhangi bir miRNA için olası mRNA hedefleri listeleri oluşturmak için güçlü bir yol olsa da, tahminlerin henüz sadece 8 güvenerek yeterince doğru değildir . Bu nedenle, araştırmacılar da hedefleri de novo öngörülen hedefler belirlemek veya doğrulamak için bir dizi deneysel yaklaşımlar kaldıraç. Birçok ekipleri ifade değişiklikleri miRNA aktivite olduğunda 4,9,10 tedirgin olan genleri tanımlamak için kararlı durum mRNA veya protein düzeyleri yüksek verimlilik önlemleri dayanıyordu. Bu tür değişiklikler, ancak bir miRNA bir transkript ve dolaylı veya alt sinyalizasyon etkileri üzerinde doğrudan etkileri arasında bir ayrım yapmaz, hiç kuşkusuz genel ifade değişiklikleri ölçerek biyolojik olarak anlamlı ve önemli bir ilk adımı temsil ediyor. MiRNA-mRNA doğrudan etkileşim için kanıt Diğer güçlü araçlar miRNA'lar ve mRNA'ların çapraz bağ argonaute proteinler (ve böylece RISC kompleksi), etkileşim ortakları belirlemek rağmen derhal işlevsel etkileri göstermek değildir kromatin-immunoprecipitation (ChIP) stratejileri gibi bağlayıcı bir olay 5,11. Böylece, belirli bir UTR miRNA etkisi için fonksiyonel kanıt 3'UTR muhabiri testlerin, kapsamlı bir miRNA çalışmanın önemli bir bileşeni haline gelmiştir. Hesaplamalı hedef öngörüleri veya ifade ve proteomik verileri ile birlikte ele alındığında bu hücre bazlı analiz verileri belirli bir 3'UTR doğrudan ilgi miRNA tarafından düzenlenir dair güçlü kanıtlar sağlar. 3'UTR muhabiri tahlil, ilgi bir gen 3'UTR lusiferaz muhabiri gen sonuna kadar erimiş. 3'UTR bir miRNA bir hedef ise, muhabir transkript istikrar ve / veya çeviri verimliliği fonksiyonel miRNA konsantrasyon değişimi ile değişecektir. Yani transkript-bazlı testlerin aksine, muhabir testlerinde istikrarlı bir devlet mRNA ve protein düzeyleri üzerindeki etkileri tespit yardımcı olur. Muhabir sistemleri de aslında interaction8 için gerekli olduğunu onaylamak için bir 3'UTR bir varsayılan miRNA bağlayıcı site mutagenizing fonksiyonel etkilerini incelemek için de kullanılıyor olabilir. Ifade diziler, proteomik teknikler ve argonaute ChIP kullanarak büyük ölçekli çalışmalar, çok az sayıda deneysel koşullar, hücre tabanlı muhabiri deneyleri için değerli genom veri sağlar miRNA-3 'çalışma için ölçeklendirme için en müsait UTR etkileşimler gibi koşullar yüzlerce ya da binlerce küçük moleküller veya diğer kütüphane tabanlı etkileyiciler yüksek verimli tarama için gerekli olabilir. Birçok bilim adamı çalışma miRNA 3'UTR etkileşimleri muhabiri tahlil teknolojisini uyguladık. Ancak, birçok miRNA'lar her hedef yüzlerce farklı transkript, yüksek verimli bir ölçekte bu güçlü bir yaklaşım kullanmak için araştırmacılar için zor olduğunu fikri ile binlerce farklı oluşturmak için klonlama, doğrulama ve optimizasyon adımları çünkü 3'UTR muhabir vektörler pahalıdır maliyet. 3'UTR-muhabiri, küçük ve büyük ölçekli çalışmalar herhangi bir araştırmacı için ulaşılabilir kılmak amacıyla, biz, insan 3'UTRs yüksek optimize LightSwitch Lusiferaz Testi Sistemi içine önceden klonlanmış bir genom-geniş bir koleksiyon oluşturduk. Muhabir sistemi de doğrulanmış kontrolü vektörler, pozitif kontrol olarak kullanılmak üzere 700'den fazla sentetik miRNA hedef muhabiri yapıları bir dizi ve bir dizi standart deney protokolleri içerir. Aşağıdaki protokolü kullanarak, belirli bir insan 3'UTR ilgi miRNA bir hedef olup olmadığını sorabilirsiniz. Bu iş akışında kritik adımlar, deneysel tasarım, muhabir yapıları ve miRNA taklit transfeksiyon, lusiferaz muhabiri testleri ve veri analizi. Deneysel tasarım, düşünceli bir transfectable hücre hattı, deney ve kontrol muhabiri yapıları, ve miRNA taklit ve hedefleme kontrolleri önemlidir. Ortak yüksek transfectable adhHT1080, HepG2 gibi erent hücre hatları, HCT-116, Hela, 293, ve diğerleri genellikle bu protokol ile iyi çalışır. Deneysel tasarım ile ilgili önemli notlar LightSwitch Lusiferaz Testi Sistemi RenSP lusiferaz gen ve LightSwitch Lusiferaz Testi Reaktifler kullanan GoClone yapıları içeren bir tam optimize muhabiri sistemi. En iyi muhabir tahlil sonuçları elde etmek için önerilen LightSwitch Sistem tüm bileşenleri kullanın. Şalt GoClone muhabiri yapıları ile herhangi bir oligos / plazmid Co-transfeksiyon non-spesifik bir şekilde genel lusiferaz sinyalleri azaltır. Bu nedenle, aşağıdaki transfeksiyon kombinasyonları gerçekleştirmek için önemlidir: sadece muhabir, muhabir + hedefleme kontrolü miRNA ve muhabiri + özel miRNA. Empty_3UTR vektör (güçlü organizatörü, UTR yok) lusiferaz sinyal çok yüksek bir seviyeye sağlar ve transfeksiyon verimliliği için bir pozitif kontrol olarak hizmet vermektedir ve sentetik miRNA hedef muhabiri vektör taklit aktivite için bir pozitif kontrol olarak hizmet verebilir. Buna ek olarak, biz doğru sıra-özel vs non-spesifik etkileri ayırmak için GoClone 3'UTR temizlik kontrolleri ve rasgele denetimler kullanmanızı öneririz. Çalışma protokolü ve mümkün pipetleme hata veya buharlaşma nedeniyle veri değişkenliği azaltmak için master miksler yapmak. Bu protokol DharmaFect Duo transfeksiyon reaktifi (Dharmacon) kullanır. 1. Gün ÖNEMLİ İPUCU: hücre hattı akıllıca seçin. En iyi sonuç için, transfectable olduğu bilinen bir hücre hattı kullanın. Biz de o belirli miRNA yüksek endojen seviyeleri ile hücre hatları içinde zayıflatılmış bir miRNA 3 'UTR muhabiri ölçülebilir yanıt taklit olduğunu bulduk. Hücre hattı ifade miRNA nasıl bilmiyorsanız, dolaylı bir hücre, testin dinamik aralık olarak bildiren yanı sıra belirli bir miRNA bolluğu önlemler SGG sentetik microRNA hedef deneyin. 1. Tohum hücreleri transfeksiyon süresi ≥ 80% izdiham verim. Tohum hücreleri 100μl toplam hacmi 96-de beyaz TC plaka. Izdiham değerlendirmek için net 96-plaka paralel, tohum hücrelerin uygun sayıda. ÖNEMLİ İPUCU 1: Confluence taklit deney iyi sonuçlar elde anahtarıdır. Optimum demonte için, hücre Transfeksiyondan zamanda konfluent% 100 olmalıdır. ÖNEMLİ İPUCU 2: En iyi sonuçları elde etmek için düşük geçit hücreleri kullanın. Çok kez geçişli olan hücreler gürültülü transfeksiyon veri verim eğilimindedir. 2. Gün GoClonereporter yapıları ve miRNA'lar hazırlayın, sonra konfluent hücrelerin içine transfect. 2. Oluşturur hazırlayın Çözülme GoClone yapıları oda sıcaklığında (plazmid DNA). İyice karıştırın. Santrifüj kapağı yoğunlaşma kaldırmak için. 3. Mikro RNA'lar hazırlayın Oda sıcaklığı ve yoğuşma kapakları kaldırmak için santrifüj çözülme microRNA (özel taklit ve hedefleme olmayan kontroller). RNaz içermeyen su 2 mcM bir çalışma konsantrasyonu seyreltilir. Deneysel bir miRNA ek olarak DAİMA olmayan bir hedefleme miRNA kontrolü de taklit ediyor. Co-transfecting plazmid ve küçük bir RNA oligo yalnız plazmid transfecting daha düşük sinyal yol açar. Bir veya daha fazla pozitif kontroller içerir. SGG katalog sentetik miRNA hedef muhabiri vektörler yüzlerce birini kullanmayı düşünün. Bir veya daha fazla negatif veya non-spesifik kontrolleri ekleyin. SGG kontrolleri 3 'UTRs housekeeping genler, rastgele parçaları ve / veya boş (hayır UTR insert) kontrolü de dahil olmak üzere bir dizi vardır. Bir veya daha fazla deneysel bir yapı ile birlikte bu denetimleri özel miRNA veya olmayan hedefleme kontrolü aşırı ekspresyonu atfedilebilecek herhangi bir non-spesifik etkileri normalleştirmek için izin verecektir. 4. Transfections hazırlayın Her transfeksiyon için tek bir tahlil için aşağıdaki reaktifler birleştirmek: Karışım 1 Bireysel GoClone muhabiri: 3.33 mcL microRNA: * Değişir. Serum ücretsiz medya: 10 mcL * Etkili konsantrasyon miRNA 10 nM-100 nM değişebilir. Uygun konsantrasyonu için miRNA üreticisine danışın. ÖNEMLİ İPUCU: taklit çok fazla eklemek etmeyin. Taklit konsantrasyonları için makul bir son 100uL reaksiyon aralığı 10-50 nM. En az üç çoğaltma gerçekleştirinte her bir tedavi / UTR kombinasyonu transfections ve hata pipetleme izin vermek için ek hacim içerir. Örneğin, hata veya buharlaşma pipetleme için ekstra dahil olmak üzere 3 çoğaltmak transfeksiyon kuyu için yeterli transfeksiyon karışımı elde etmek için tek bir reaksiyon hacimleri 3.5 ile çarpın. Her muhabir için, aşağıdaki çoğaltır kurmak sadece muhabir, muhabir + hedefleme kontrolü miRNA ve muhabir + özel miRNA. Olmayan bir hedefleme kontrolü için olduğu gibi, aynı zamanda hedef microRNA transfections ayarlayın. DharmaFECT DUO (Dharmacon) karışımı olarak her transfeksiyon için aşağıdaki Makyaj: Karışım 2 DharmaFect Duo: 0.15 mcL Serum ücretsiz medya: 9,85 mcL DharmaFECT Duo eklenecek miktar bağımlı hücre hattı olabilir. Yukarıda belirtilen miktarda HT1080 hücreler için uygun. Hücre hattı için uygun miktarını belirlemek için üreticinin belgelerine bakın. İpucu: gazetecilere sayısına göre yukarıdaki miktarlar çarpılarak büyük bir transfeksiyon karışımı olun sayısını çoğaltır ve miRNA'lar sayısı test edilecek. Transfeksiyon karışımı hazırlamak için miktarı hesaplanırken, hataları ve buharlaşma pipetleme için hesap için ekstra bir miktar eklemeyi unutmayın. DharmaFECT Duo karışım 5 dakika oda sıcaklığında inkübe izin verin. 5 dakika sonra, hazırlanan 10uL plazmid ve / veya miRNA (Karışım 1) her tüp DharmaFECT Duo karışımı (Karışım 2) 10μL ekleyin. Her tüp daha sonra çoğaltmak transfeksiyon başına 20μL hacmi içermelidir. Her karışımı oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. 20 dakika sonra, her tüp çoğaltmak transfeksiyon başına 100μL toplam 80 mcL çoğaltmak için önceden ısıtılmış (37 ° C), antibiyotik içermeyen, tam medya ekleyin. Birçok eş zamanlı olarak çoğaltır ve örnekler hazırlanması için kullanılan derin kuyu blok olabilir. Yukarı ve aşağı pipetleme çözüm karıştırın. Inkübatör numaralı seribaşı plaka çıkarın. Hücrelerin en az% 80 konfluent olduğundan emin olun. Her kuyudan medya kapalı dikkatlice pipetlemeyin. Her iyi transfeksiyon karışımı (20uL DNA / reaktif karışımı + 80uL medya) 100μL ekle. Gecede inkübatör yerleştirin plakası. Aşırı inkübe etmeyin. En çok taklit eden 24 saat içinde iyi niyetli hedefleri üzerinde önemli sonuçlar üretecektir. 48 saat ölçülebilir baskı daha büyük olabilir, ama çok iyi değişkenlik iyi olacak. Mimik deneyler inhibitörü deneyler daha kolaydır. En çok taklit eden 24 saat içinde gerçek hedefleri önemli ölçüde bastırmak da inhibitörü ilişkin de baskının önemli ölçülebilir olması için 48 saat alabilir ve hemen hemen her zaman taklit etkisi daha az belirgin olacaktır. 3. Gün Not: Lusiferaz testlerin hemen yapılabilir ya da plakaları -80 dondurulmuş olabilir ° C (donma genellikle hücre lizis ve lusiferaz sinyal artar) . Dondurma ve en iyi sonuç için assaying önce hücreleri Çözülme. LightSwitch Testi Reaktif eklemeden önce oda sıcaklığına kadar donmuş hücreleri çözülme izin UNUTMAYIN. 5. LightSwitch AssayReagents ile ölçün lusiferaz aktivitesini Inkübatör plakasını çıkarın ve oda sıcaklığına getirmek. LightSwitch Testi Reaktifler (LS010 kiti için, diğer kiti boyutları protokolleri çevrimiçi bulunabilir) hazırlayın: Liyofilize Testi Yüzey tüp Solvent Yüzey 100μL ekleyerek sulandırın 100X Yüzey ışıktan koruyunuz ve oda sıcaklığında süresini en aza indirmek. 100X Yüzey, 2-3 haftayı-20C saklanabilir . En iyi sonuç için, taze sulandırılmış substrat kullanın. Testi Buffer oda sıcaklığında su banyosunda 10 ml şişe çözülme Testi Çözüm hazırlayın ve kullanmadan önce sulandırılmış 100X Yüzey 100μL ekleyin. İyice karıştırın. Doğrudan beyaz 96-plaka Her numune (100uL hücreleri + medya içeren) 100μL LightSwitch Assay Çözümü (buffer + substrat) eklemek için bir çok kanallı pipet kullanın. Hücreleri başka bir plaka veya cam şişe biçimi, transfer örnekleri yetiştirilen olsaydı 100μL toplam hacmi (medya ya da PBS) beyaz 96 plaka. Kapak plakası, ışıktan korumak ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Eğer birden fazla plaka assaying, böylece her bir plaka okuma 30 dakika önce kuluçkaya yanı sıra tahlil çözüm bocalama . 2 saniye boyunca her bir plaka lumi iyi okuyunnometer (SPECTRAmax L veya muadili). (Lüminesans = Belirli miRNA / kontrol dışı hedef), hedefleme kontrolü üzerinde özel miRNA için her bir yapı için lusiferaz sinyal oranını hesaplarken demonte hesaplayın. UTR non-spesifik tedavi etkileri kontrol etmek için temizlik, rastgele ve boş yapıları verileri kullanın. Temsilcisi Sonuçlar Bir hedefleme miRNA varlığı 3'UTR hedefleri lusiferaz demonte göstermektedir. Let-7a 3'UTR lusiferaz muhabiri faaliyet demonte Işıklı muhabiri okuduktan sonra, 24 saat süreyle inkübe 20nm izin 7a taklit veya hedefleme kontrolü ile inşa HT1080 hücrelerinde her muhabir co-transfecting 100ng tarafından ölçüldü LightSwitch Lusiferaz Testi Reaktifler kullanarak sinyal. Şekil 1. Nokt ve ARID3B insan 3'UTRs let-7a microRNA hedeflerdir. Nokt ve ARID3B genlerin insan 3'UTR gazetecilere gelen sinyaller let-7a microRNA varlığı önemli ölçüde yere serdi taklit ederken temizlik ve rasgele sıra sinyalleri UTRs değil.