Het identificeren van doelen van Human microRNA's met de LightSwitch Luciferase Assay System met behulp van 3'UTR-reporter constructen en een microRNA Mimic in hechtende cellen

Introductie MicroRNA naar voren zijn gekomen als belangrijke regulatoren van genexpressie die de activiteit van vele belangrijke biologische processen moduleren. Met meer dan 700 menselijke miRNAs geïdentificeerd tot nu toe 1, is het niet verwonderlijk dat de mutaties en onjuiste regelgeving van miRNAs zijn gekoppeld aan een verscheidenheid van fysiologische aandoeningen zoals kanker en hart-en vaatziekten 2,3. Recente studies hebben aangetoond dat de meerderheid van de miRNA regelgeving bindingsplaatsen zijn te vinden in 3'UTRs 4,5, en sommige onderzoekers hebben geschat dat er honderden van doelen per miRNA in de cel 6. Gezien het biologische belang van miRNAs, het grote aantal miRNAs die bestaan ​​en het grote aantal doelstellingen voor elk van hen, is het essentieel dat onderzoekers in staat zijn om betrouwbaar te identificeren endogene doelstellingen van miRNAs, bij voorkeur op platforms vatbaar is voor high-throughput studies. Terwijl met behulp van computationele gereedschappen, zoals miRBase, TargetScan en PicTar 1,6,7 is een krachtige manier om lijsten van vermeende mRNA doelstellingen voor elke miRNA genereren, de voorspellingen zijn nog niet nauwkeurig genoeg om een beroep worden gedaan alleen 8. Daarom onderzoekers leverage ook een aantal experimentele benaderingen om targets te identificeren of de novo te voorspelde targets te valideren. Veel teams hebben vertrouwd op high-throughput metingen van steady-state-mRNA of eiwit niveaus genen voor die tot uitdrukking verandert als miRNA activiteit wordt verstoord 4,9,10 identificeren. Dergelijke veranderingen zijn ongetwijfeld biologisch zinvol en vormen een belangrijke eerste stap, maar het meten van veranderingen in de totale expressie niet tussen de directe effecten van een miRNA te onderscheiden op een transcript en indirecte of stroomafwaarts signalering effecten. Andere krachtige tools die bewijs te leveren voor de directe miRNA-mRNA interacties chromatine-immunoprecipitatie (ChIP) strategieën die cross-link Argonaute eiwitten (en dus de RISC complex) om miRNAs en mRNA's, hoewel het identificeren van de interagerende partners niet direct de functionele effecten geven van een dergelijk evenement een bindende 5,11. Zo zijn 3'UTR-reporter assays die functioneel bewijs voor effect een miRNA's op een bepaalde UTR bieden uitgegroeid tot een belangrijk onderdeel van een grondige miRNA onderzoek. Een dergelijke cel-gebaseerde test gegevens, samen met computationele doel voorspellingen of expressie en proteomics data genomen levert sterke aanwijzingen dat een bepaalde 3'UTR direct wordt geregeld door de miRNA van belang. In een 3'UTR-reporter assay, is de 3'UTR van een gen van belang gefuseerd aan het einde van een luciferase reporter-gen. Als de 3'UTR is een doelwit van een miRNA, zal de verslaggever transcript stabiliteit en / of de vertaling ervan efficiëntie te veranderen met variatie in functionele miRNA concentratie. Dus in tegenstelling tot transcript-only gebaseerde testen, reporter assays helpen bij het identificeren effecten op zowel steady-state mRNA en eiwit niveaus. Reporter systemen kunnen ook worden gebruikt om de functionele effecten van mutagenizing een vermoedelijke miRNA bindingsplaats in een 3'UTR om te bevestigen dat het inderdaad noodzakelijk is voor de interaction8 studie. En terwijl grootschalige studies met behulp van expressie arrays, proteomics technieken en Argonaute ChIP waardevolle genoom-brede gegevens voor een klein aantal experimentele condities, cel-gebaseerde reporter assays zijn het meest vatbaar voor het opschalen van voor de studie van miRNA-3 ' UTR interacties in honderden of duizenden van voorwaarden die noodzakelijk zijn voor high-throughput screening van kleine moleculen of andere bibliotheek op basis van effectoren. Veel wetenschappers hebben toegepast reporter test technologie om de studie van miRNA-3'UTR interacties. Echter, met het idee dat veel miRNAs elke doelgroep honderden verschillende transcripten, het is moeilijk geweest voor onderzoekers om deze krachtige aanpak te gebruiken op een high-throughput schaal, omdat het klonen, validatie en optimalisatie van de stappen voor het creëren van duizenden verschillende 3'UTR- reporter vectoren zijn vaak onbetaalbaar. In een poging om kleine-en grootschalige 3'UTR-reporter studies toegankelijk is voor elke onderzoeker te maken, hebben we een genoom-brede verzameling van menselijke 3'UTRs pre-gekloneerd in de zeer geoptimaliseerde LightSwitch Luciferase Assay System. De verslaggever systeem omvat ook de gevalideerde controlemethoden vectoren, een reeks van meer dan 700 synthetische miRNA doelwit reporter constructen voor gebruik als positieve controles, en een reeks van gestandaardiseerde experimentele protocollen. Met behulp van de volgende protocol, kunt u vragen of een bepaalde menselijke 3'UTR is een doel van je miRNA van belang. De kritische stappen in deze workflow zijn experimentele opzet, transfectie van reporter constructen en miRNA nabootst, luciferase reporter assays, en data-analyse. Voor de experimentele opzet, is het belangrijk zorgvuldig selecteert u een transfectable cellijn, experimentele en controle reporter constructen, en miRNA mimiek en non-targeting controles. Vaak zeer transfectable ADHErent cellijnen zoals HT1080, HepG2, HCT-116, Hela, 293, en anderen vaak goed te werken met dit protocol. Belangrijke opmerkingen over proefopzet De LightSwitch Luciferase Assay System is een volledig geoptimaliseerd verslaggever systeem dat GoClone construeert met behulp van de RenSP luciferase gen en LightSwitch Luciferase Assay reagentia omvat. Gebruik alle componenten van het systeem LightSwitch zoals aanbevolen om een ​​optimale reporter test resultaten te verkrijgen. Co-transfectie van een oligo / plasmiden met Schakelapparatuur GoClone reporter constructen vermindert de totale luciferase signalen in een niet-specifieke manier. Daarom is het belangrijk om de volgende transfectie combinaties: alleen reporter, verslaggever + niet-gerichte controle miRNA, en verslaggever + specifieke miRNA. Onze empty_3UTR vector (een sterke promotor, geen UTR) biedt een zeer hoog niveau van luciferase-signaal en dient als een positieve controle voor transfectie-efficiëntie, en een synthetische miRNA doelwit verslaggever vector kan dienen als een positieve controle voor na te bootsen activiteit. Daarnaast adviseren wij het gebruik van de GoClone 3'UTR huishouden controles en willekeurige controles voor het nauwkeurig scheiden van sequentie-specifieke versus niet-specifieke effecten. Onderzoek uw protocol en waar mogelijk te maken mastermengsels af te nemen de variabiliteit in de gegevens als gevolg van pipetteren fout of verdamping. Dit protocol maakt gebruik van DharmaFect Duo transfectiereagens (Dharmacon). Dag 1 BELANGRIJK TIP: wijs Kies uw cellijn. Voor het beste resultaat, gebruik dan een cellijn waarvan bekend is dat zijn transfectable. We hebben ook geconstateerd dat de meetbare reactie van een 3 'UTR reporter naar een miRNA na te bootsen is verzwakt in cellijnen met een hoge endogene niveau van die bepaalde miRNA. Als je niet weet hoeveel miRNA uw mobiele lijn tot uitdrukking brengt, probeer dan synthetische microRNA SGG-doelstelling die indirect meet de overvloed van een bepaalde miRNA in een cel als u te informeren met betrekking tot het dynamische bereik van uw test. 1. Zaad cellen ≥ 80% confluentie opbrengst op het moment van transfectie. Zaad cellen in een 96-well plaat in wit TC 100μl totale volume. Parallel, zaad het juiste aantal cellen in een duidelijke 96-wells plaat voor het beoordelen van samenvloeiing. BELANGRIJK TIP 1: Confluence is de sleutel tot het bereiken van goede resultaten in een na te bootsen experiment. Voor een optimale knockdown, moet cellen 100% confluent op het moment van transfectie. BELANGRIJK TIP 2: Gebruik lage passage cellen voor de beste resultaten. Cellen die zijn gepasseerd te vaak de neiging om luidruchtige transfectie gegevens opleveren. Dag 2 Bereid GoClonereporter bouwt en miRNAs, dan transfecteren in de samenvloeiing cellen. 2. Voor te bereiden constructen Dooi GoClone constructen (plasmide DNA) bij kamertemperatuur. Meng goed. Centrifuge om condensatie te verwijderen van de dop. 3. Voor te bereiden Micro RNAs Dooi microRNAs (specifieke imiteert en niet-gericht controles) bij kamertemperatuur en centrifugeer om condensatie te verwijderen uit de doppen. Verdunnen tot een werkende concentratie van 2 uM in RNase-vrij water. In aanvulling op een experimentele miRNA na te bootsen ALTIJD een niet-gericht miRNA controle. Co-transfectie een plasmide en een kleine RNA-oligo leidt tot lagere signaal dan transfectie het plasmide alleen. Een of meer positieve controles. Overweeg het gebruik van een van de honderden synthetische miRNA doel reporter vectoren in de catalogus SGG's. Een of meer negatieve of niet-specifieke controles. SGG heeft een bereik van controles, waaronder 3 'UTR's van housekeeping genen, willekeurige fragmenten en / of de lege (geen UTR insert) controle. Het gebruik van een of meer van deze controles naast een experimentele constructie zal u toelaten om te normaliseren voor een niet-specifieke effecten toe te schrijven aan de overexpressie van uw specifieke miRNA of het niet-gericht te controleren. 4. Voor te bereiden Transfecties Voor elke transfectie combineren de volgende reagentia voor een test: Mengsel een Individuele GoClone verslaggever: 3,33 pi microRNA: Varieert * Serum-vrije media: tot 10 pi * Effectieve concentratie van miRNA kan variëren van 10 nm-100 nM. Neem contact op miRNA fabrikant voor de juiste concentratie. BELANGRIJK TIP: Voeg geen al te veel na te bootsen. Een redelijk bereik voor nabootsen concentraties is 10-50 nm in de finale 100uL reactie. Voer ten minste drie replicate transfecties voor elke behandeling / UTR combinatie en ook extra volume toe te staan ​​voor het pipetteren fout. Bijvoorbeeld, vermenigvuldig de enkele reactie volumes met 3,5 genoeg transfectie mix voor 3 repliceren transfectie putten inclusief extra voor het pipetteren fouten of verdamping te krijgen. Voor elke journalist, opgericht repliceert voor de volgende: reporter alleen, reporter + niet-targeting controle miRNA en verslaggever + specifieke miRNA. Stel transfecties voor het richten microRNA op hetzelfde tijdstip als die voor een niet-gericht te controleren. Make-up de DharmaFECT DUO (Dharmacon) mengsel als volgt over de transfectie: Mengsel 2 DharmaFect Duo: 0,15 pi Serum vrije media: 9,85 pi De hoeveelheid DharmaFECT Duo te worden toegevoegd, kunnen cellijn afhankelijk zijn. De bedragen die hierboven aangegeven zijn geschikt voor HT1080 cellen. Raadpleeg de documentatie van de fabrikant om de juiste hoeveelheid te bepalen voor uw cellijn. Tip: Maak een grote transfectie mengsel door vermenigvuldiging van de volumes boven door het aantal verslaggevers, het aantal herhalingen en het aantal miRNAs te testen. Bij de berekening van de transfectie mix voor te bereiden, moet u een klein bedrag extra om rekening te houden pipetteren fouten en verdamping te nemen. Laat het DharmaFECT Duo mengsel bij kamertemperatuur incuberen gedurende 5 minuten. Na 5 minuten, voeg 10μL van de DharmaFECT Duo mengsel (mengsel 2) met elk bereid tube van 10uL plasmide en / of miRNA (mengsel 1). Elke buis moet dan bevatten een volume van 20μL per repliceren transfectie. Incubeer elk mengsel gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Na 20 minuten, voeg 80 ul van voorverwarmde (37 ° C), antibiotica-vrij, complete media per repliceren aan elke buis voor een totaal van 100μL per repliceren transfectie. Een diep-goed blok kan worden gebruikt voor de bereiding van de vele herhalingen en monsters tegelijk. Meng de oplossing door en neer te pipetteren. Verwijder de zaadjes plaat uit de incubator. Controleer of de cellen ten minste 80% confluent. Voorzichtig pipet uit de media uit elk putje. Voeg 100μL van de transfectie mengsel (20uL DNA / reagens mix + 80uL media) aan elk putje. Laat de plaat in de broedstoof 's nachts. Niet te broeden. De meeste bootst zal produceren significante resultaten op bona fide targets binnen 24 uur. Het niveau van de repressie meetbaar na 48 uur kan groter zijn, maar zo zal het goed om goed te variabiliteit. Mimic experimenten zijn gemakkelijker dan remmer experimenten. Terwijl de meeste bootst zal aanzienlijk onderdrukken echte doelen binnen 24 uur, belangrijke de-repressie toe te schrijven aan de remmer kan 48 uur meetbaar en zal bijna altijd minder uitgesproken dan het effect van de na te bootsen. Dag 3 Let op: Luciferase assays kan onmiddellijk worden uitgevoerd of de platen kunnen ingevroren worden bij -80 ° C (bevriezen stijgt over het algemeen cel lysis en luciferase signaal). Bevriezen en ontdooien uw cellen voordat het testen voor de beste resultaten. VERGEET NIET op bevroren cellen te ontdooien verhuurd aan kamertemperatuur voordat je LightSwitch Assay Reagens. 5. Meet luciferase activiteit met LightSwitch AssayReagents Verwijder de plaat uit incubator en breng aan de kamertemperatuur. Bereid LightSwitch Assay Reagentia (voor de LS010 kit, protocollen van andere kit maten kunnen online te vinden): Reconstitueer 100X ondergrond door het toevoegen van 100μL van de ondergrond Solvent om buis van gevriesdroogde Assay substraat. Beschermen tegen licht en het minimaliseren van de tijd bij kamertemperatuur. 100X substraat kan worden bewaard bij-20C voor 2-3 weken. Voor de beste resultaten, gebruik van vers bereide substraat. Bereid Assay Oplossing door ontdooien 10 ml fles of Assay Buffer in water op kamertemperatuur bad en voorafgaande toe te voegen 100μL van gereconstitueerde 100X ondergrond te gebruiken. Meng goed. Gebruik een multi-channel pipet om 100μL LightSwitch Assay Solution (buffer + substraat) rechtstreeks toevoegen aan elk monster goed (met 100uL cellen + media) in een witte 96-well plaat. Als cellen werden gekweekt in een ander bord of fles formaat, overdracht monsters een witte 96-wells plaat in 100μL totale volume (media of PBS). Afdekplaat, beschermen tegen licht, en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Als het testen van meer dan een plaat, toevoeging van de analyse-oplossing, zodat iedere plaat broedt gedurende 30 minuten vóór het lezen wankelen. Lees elke goed voor 2 seconden in een plaat armaturennometer (SpectraMax L of gelijkwaardig). Bereken de knockdown door het berekenen van luciferase signaal ratio voor elke bouwen voor specifieke miRNA over de niet-gerichte controle (luminescentie = specifiek miRNA / niet-targeting controle). Gebruik de gegevens van huishouden, random, en lege bouwt om te controleren voor niet-UTR specifieke behandeling effecten. Representatieve resultaten 3'UTR doelen in de aanwezigheid van een targeting miRNA zien luciferase knockdown. De knockdown van 3'UTR-luciferase reporter-activiteit door de let-7a werd gemeten in HT1080 cellen door co-transfecteren 100ng van elk reporter bouwen met 20nm let-7a na te bootsen of niet-gerichte controle, incuberen voor 24 uur, dan is het lezen van het luminescerende verslaggever signaal met behulp van LightSwitch Luciferase Assay Reagentia. Figuur 1. PUNC en ARID3B menselijke 3'UTRs doelwit zijn van de laat-7a microRNA. Signalen van menselijke 3'UTR verslaggevers voor de PUNC en ARID3B genen zijn aanzienlijk neergehaald in de aanwezigheid van de laat-7a microRNA na te bootsen, terwijl signalen voor het huishouden en willekeurige volgorde UTR's niet.