Nós estabelecemos um protocolo para indução de neuroblastos direta de pluripotentes células estaminais embrionárias humanas mantidas sob condições definidas com pequenas moléculas, que permite a derivação de uma grande oferta de recursos humanos progenitores neurais e células neuronais tipos no desenvolvimento neural do SNC para reparação.
Há uma grande necessidade insatisfeita para uma fonte de células clinicamente adequado humana neuronal para reparo ou regeneração do sistema nervoso central, danificada (CNS) a estrutura e os circuitos na indústria de hoje de saúde. Terapias baseadas em células uma grande promessa para restaurar o tecido nervoso e perdeu a função de doenças do SNC. No entanto, as terapias celulares com base no SNC derivados células-tronco neurais têm encontrado restrição da oferta e dificuldade de uso na prática clínica devido à sua capacidade de expansão limitada da cultura e plasticidade falhando após extensa 03/01 passaging. Apesar de alguns resultados positivos, o CNS-derivadas de células-tronco neurais (hNSCs) parecem exercer seus efeitos terapêuticos principalmente por sua não-neuronal através de progênies tróficos produção e moléculas neuroprotetor para resgatar as células endógenas 1-3. Alternativamente, pluripotentes células estaminais embrionárias humanas (hESCs) curas oferecer para uma ampla gama de distúrbios neurológicos por supplying a diversidade de tipos humanos de células neuronais no SNC em desenvolvimento para a regeneração 1,4-7. No entanto, como canalizar o potencial de diferenciação gama de hESCs pluripotentes de forma eficiente e previsível para um fenótipo desejado tem sido um grande desafio tanto para estudo de desenvolvimento e tradução clínica. Abordagens convencionais dependem de multi-linhagem inclinação de células pluripotentes através da diferenciação espontânea germe de camada, resultando em ineficiência e incontrolável linhagem compromisso, que é muitas vezes seguido de heterogeneidade fenotípica e instabilidade, portanto, um risco elevado de tumorigenicidade 7-10. Além disso, indefinido estrangeiros / animal suplementos biológicos e / ou alimentadores que tenham sido tipicamente usadas para o isolamento, expansão e diferenciação de hESCs pode fazer uso direto de tais células especializadas enxertos em pacientes problemáticos 11-13. Para superar esses obstáculos, temos resolvido os elementos de um sistema de cultura definidas necessárias e suficientes para sustaining o pluripotence epiblasto de hESCs, servindo como uma plataforma para a derivação de novo de hESCs clinicamente adequado e eficaz direcionando hESCs tais uniformemente para linhagens clinicamente relevante por pequenas moléculas 14 (consulte um esquema na figura 1.). Ácido retinóico (AR) não induz a diferenciação neuronal de hESCs indiferenciada mantidos em alimentadores de 1, 14. E, ao contrário CES mouse, tratando CTEh diferenciadas corpos embrióides (EBs) só aumenta um pouco o baixo rendimento dos neurônios 1, 14, 15. No entanto, após a triagem de uma variedade de pequenas moléculas e fatores de crescimento, verificou-se que tais condições definidas prestados ácido retinóico (RA) suficiente para induzir a especificação de neuroectoderma direta de hESCs pluripotentes que mais progrediu para neuroblastos que gerou humana progenitores neurais e neurônios na SNC em desenvolvimento com alta eficiência (Fig. 2). Nós definimos as condições para a indução de neuroexplosões diretas de hESCs pluripotentes sem uma intervenção multi-estágio corpo linhagem embrióides, permitindo bem controlados derivação eficiente de uma grande oferta de células neuronais humanas em todo o espectro de estágios de desenvolvimento para a célula-base terapêutica.
Um dos grandes desafios tanto para estudos de desenvolvimento e tradução clínica tem sido a forma de canalizar o potencial de diferenciação gama de células-tronco pluripotentes humanas a um fenótipo desejado de forma eficiente e previsível. Apesar de tais células podem se diferenciar espontaneamente in vitro em células de todas as camadas germinativas, passando por uma fase agregado multi-linhagem, apenas uma pequena fração de células perseguir um 1,4 linhagem dada. Naqueles agregados CTEh derivados, o aparecimento simultâneo de uma quantidade substancial de amplamente divergentes tipos de células indesejadas que podem residir em três folhetos embrionários, muitas vezes faz com que o surgimento de fenótipos desejados não só ineficiente, mas incontroláveis e não confiável também. Embora linhagens cardíaco e neural foram derivados em relatórios anteriores, no entanto, a ineficiência na geração de células especializadas, por meio de germes camada de indução de células pluripotentes e alto risco de tumorigenicidade seguintes transplantation têm impedido de nova tradução clínica.
As linhas CTEh inicialmente foram obtidos e mantidos em co-cultura com crescimento de fibroblastos de rato preso embrionárias (MEFs) 4. Apesar de alimentador humanas diversas, alimentador-livre, e sistemas de cultura quimicamente formuladas têm sido desenvolvidos para hESCs 11-13, os elementos necessários e suficientes para sustentar a auto-renovação das células pluripotentes humanas permanecem sem solução. Estas células de alimentação exógena e reagentes biológicos ajudam a manter o crescimento estável a longo prazo de hESCs indiferenciada, enquanto máscara a capacidade das células pluripotentes a responderem aos sinais de desenvolvimento. Manter hESCs indiferenciado em um sistema de cultura definida biológicos livre que permite a expansão fiel e diferenciação direta controlável é uma das chaves para a sua utilidade terapêutica e potenciais. RA não foi suficiente para induzir a diferenciação neuronal de hESCs indiferenciada mantido sob Condit anteriormente relatadosíons contendo células de alimentação exógena. Embora linhagens neural aparecer em um estágio relativamente inicial na diferenciação CTEh, tratando CTEh diferenciadas multi-linhagem agregados (corpos embrióides) com AR apenas um ligeiro aumento do baixo rendimento dos neurônios 1, 14, 15. A fim de alcançar uniformemente conversão de células pluripotentes estaminais humanas a uma linhagem especial, empregamos um sistema de cultura definido capaz de segurar a proliferação de hESCs indiferenciado para identificar as condições para o bem-controlados de indução eficiente de hESCs pluripotentes exclusivamente para uma determinada linhagem clinicamente relevante pelo simples fornecimento de pequenas moléculas (Fig. 1, fig. 2). Futuros estudos revelarão moléculas controle genéticas e epigenéticas no desenvolvimento do SNC humano como alternativas, que podem pavimentar o caminho para o controle de molécula pequena mediada direta e modulação do destino pluripotentes CTEh quando derivar linhagens clinicamente relevantes para terapias regenerativas. RA sem tratamento, 1-5HESCs% serão submetidos a diferenciação espontânea em neurônios 1, 14, 15. Com o tratamento RA, temos sido capazes de gerar> 95% embrionárias progenitores neurais e de neurônios a partir de hESCs mantido sob uma cultura define em um processo que pode emular o desenvolvimento embrionário humano 14. Recentemente, conhecido destino neural-determinação genes têm sido usados para transdifferentiate fibroblastos de rato adulto em progenitores neurais e neurônios com uma baixa eficiência variando 0,5-8% 17, 18. No entanto, as células somáticas reprogramadas têm sido historicamente associada com a expressão do gene anormal e senescência acelerada com utilidade terapêutica prejudicada 19-21. Finalmente, o protocolo que estabelecemos aqui é limitado a hESCs pluripotentes derivadas da massa celular interna (ICM) ou epiblasto do blastocisto humano 4, não se aplicar a outras células pluripotentes, incluindo animais originou-CES, CES derivadas de anteriores mórula (oito células) em estágio embriões 22, e ArtifAs células reprogramadas icially 23.
The authors have nothing to disclose.
XHP foi apoiado pelo National Institute of Health (NIH) doações do National Institute on Aging (NIHK01AG024496) e A Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health e Desenvolvimento Humano (NIHR21HD056530).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Gelatin | Sigma | G1890 | |
Matrigel | BD bioscience | 356231 | Growth factor reduced |
Human laminin | Sigma | L6274 | |
all-trans-Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
DMEM/F12 | Invitrogen | 10565018 | |
DMEM | Invitrogen | 31053036 | |
DMEM-KO | Invitrogen | 10829018 | |
Knock-out serum replacement | Invitrogen | 10828028 | |
MEM nonessential amino acid solution (MNAA, 100X) | Invitrogen | 11140050 | |
MEM amino acids solution (MEAA, 100X) | Invitrogen | 11130050 | |
β-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985023 | |
Albumax | Invitrogen | 11020021 | |
Ascorbic acid | Sigma | A4403 | |
Human transferrin | Sigma | T8158 | |
Human bFGF | PeproTech | AF-100-18B | |
Human insulin | Invitrogen | 12585014 | |
Human activin A | PeproTech | 120-14E | |
Human BDNF | PeproTech | AF-450-02 | |
Human VEGF | PeproTech | AF-100-20 | |
Human NT-3 | PeproTech | 450-03 | |
Heparin | Sigma | H5284 | |
N-2 supplement (100X) | Invitrogen | 17502048 | |
6-well ultralow attachment plate | Corning | 3471 | |
6-well plate | Corning | 3516 |