Efficiënte Afleiding van de Mens Neuronale voorouders en neuronen van pluripotente menselijke embryonale stamcellen met op kleine moleculen Inductie

1. Solution en Media Voorbereiding Gelatine coating oplossing: 0,1% (w / v) gelatine in DDH 2 O, geautoclaveerd en bewaar bij 4 ° C. Matrigel coating oplossingen. Stock oplossing: slow dooi Matrigel (10 ml) bij 4 ° C gedurende de nacht, 10 ml ijskoude DMEM of DMEM/F12 toe te voegen, goed mengen en aliquot 1 ml / tube onder gesteriliseerd weefselkweek kap, bewaren bij -20 ° C. Werkende oplossing: slow ontdooien 1 ml Matrigel aliquot bij 4 ° C gedurende 1-2 uur, transfer naar 14 ml gekoelde DMEM of DMEM/F12 en goed onder gesteriliseerd weefselkweek kap onmiddellijk mix voor het coaten. Human laminine coating oplossing: verdun 1 ml menselijke laminine-oplossing (0,5 mg / ml in Tris gebufferd NaCl, bewaren bij -80 ° C, langzame dooi bij 4 ° C gedurende 1-2 uur) met ijskoude DMEM of DMEM/F12 aan 12,5 ml werkoplossing (40 ug / ml) onder gesteriliseerde weefselkweek kap direct voor coating. Groeifactor voorraad oplossingen (500-1000X): los groeifactor bij 10 ug/ Ml in gesteriliseerde buffer (0,5% BSA, 1,0 mM DTT, 10% glycerol, 1XPBS) en op te slaan als 50 tot 100 ul / tube aliquots bij -80 ° C. All-trans-retinoïnezuur werkoplossing (1000X): 10 mM in DMSO, op te slaan in gelijke fracties bij -80 ° C. MES-media: DMEM/F12 of KO-DMEM (80%), KO serum vervanging (20%), L-alanyl-L-GLN of L-GLN (2 mM), MEM niet-essentiële aminozuren (MNAA, 1X), en β-mercapto-ethanol (100 uM), gefilterd en opgeslagen bij 4 ° C, aangevuld met 20 ng / ml bFGF voor gebruik. Of vervanging van "knock-out (KO) serum vervanging" met gedefinieerde componenten: DMEM/F12 of KO-DMEM (100%), L-alanyl-L-GLN of L-GLN (2 mM), MNAA (1x), MEM essentieel aminozuren (MEAA, 1X), en de β-mercapto-ethanol (100 uM), gefiltreerd en bewaar bij 4 ° C, aangevuld met bFGF (20 ng / ml), humane insuline (20 ug / ml), ascorbinezuur (50 ug / ml), menselijke activine A (50 ng / ml), humaan albumine / Albumax (10 mg / ml), en de menselijke transferrine (8 ug / ml) voor gebruik. NSC media: DMEM/F12 (100%), N-2 supplement (1x), heparine (8 ug / ml). 2. Plaat Coating Coat platen met gelatine: voeg 2,5 ml / putje van gelatine oplossing voor de 6 goed platen en overnacht in een 37 ° C bevochtigde incubator uitbroeden. Coat platen met laminin: chill gelatine-gecoate platen en verwijderen gelatine, voeg 2,5 ml / putje Matrigel of menselijke laminine coating werkende oplossing voor pre-gekoelde 6-well platen en incubeer ontsloten bij 4 ° C gedurende de nacht. 3. Passage en Seeding Ongedifferentieerde hESC 's onder bepaalde omstandigheden Laat hESC kolonies groeien tot 5-7 dagen oud, en neem hESC cultuur plaat te ontleden microscoop (pre-warm ontleden etappe naar 37 ° C) onder ontleden gesteriliseerd kap. Selecteer hESC kolonies te worden gesplitst. Morfologisch, moeten deze kolonies hebben> 75% ongedifferentieerd hESC 's (kleine, compacte cellen), meestal enigszins ondoorzichtige (geen witte-opgestapelde cellen, niet duidelijk-gedifferentieerde cellen) met gedefinieerde rand underneath het ontleden microscoop. Zorgvuldig een overzicht van de geselecteerde kolonies en verwijder gedifferentieerde fibroblasten laag rond de kolonie en alle gedifferentieerde onderdelen (indien aanwezig) van de kolonie met de rand van P2 steriele pipet tip of getrokken glas capillair. (Let op, pluripotent hESC 's zijn op een voorbijgaande fase, ondergaan spontane differentiatie, zelfs onder optimale omstandigheden, hoewel de voorkeur, is het moeilijk om na te gaan scripties cellen zijn 100% ongedifferentieerd onder dissectiemicroscoop,> 75% ongedifferentieerd worden meestal beschouwd als de pas punt. De gedifferentieerde cellen meestal niet zaad en blijven groeien, geëlimineerd in de passage proces) Verwijder de oude media die drijvende vrijstaande gedifferentieerde cellen door aspireren. Wassen met hESC media (zonder bFGF) een keer. Voeg 3 ml / putje verse hESC media met 20 ng / ml bFGF. Snijd de ongedifferentieerde hESC kolonies in kleine stukjes, en maak met een steriele pipet tip of getrokken glas capillair. Het zwembad van het medium met vrijstaande kolonie stukken samen in een 50 ml conische buis. Ze wast de plaat met 1 ml / putje hESC media die 20 ng / ml bFGF en het zwembad bij elkaar. Zuig het Matrigel of de menselijke laminine-oplossing uit de gecoate verse platen. Aliquot 4 ml / putje hESC media die kolonie stukken tot een 6-wells plaat. Voorzichtig dragen de plaat incubator zonder schudden en laat kolonie stukken zaad 's nachts, zonder te storen in een vochtige 37 ° C incubator met een atmosfeer van 5% CO 2. 4. Neurale Inductie van hESC 's onder gedefinieerde Culture systeem met retinoïnezuur Op dag 3 na het uitzaaien, verwijder dan de meeste van de oude media uit elk putje van de plaat en laat genoeg media om hESC kolonies te worden ondergedompeld (nooit toestaan ​​dat hESC 's uit te drogen). Te vervangen met 4 ml / putje verse hESC media met 20 ng / ml bFGF en 10 uM retinoïnezuur. Vervang de oude media met verse hESC media met 20 ng / ml en bFGF10 uM retinoïnezuur om de andere dag, en laat neurale-geïnduceerde hESC kolonies groeien tot dag 7 of 8. Alle cellen in de kolonie zal ondergaan morfologie van wijzigingen in de grote gedifferentieerde cellen die zal zich blijven vermenigvuldigen. De kolonies zullen in omvang toenemen om de plaat te dekken op dag 7 of 8, en cellen zal beginnen op te stapelen in sommige gebieden van de kolonies. 5. Voortzetting van neuronale differentiatie in suspensie Cultuur Neem hESC cultuur plaat te ontleden microscoop (pre-warm ontleden etappe naar 37 ° C) onder ontleden gesteriliseerd kap. Voorzichtig een overzicht van de koloniën en verwijder fibroblast laag rond de kolonie (gedifferentieerde cellen migreerden uit de kolonie) met de rand van de P2 steriele pipet tip of getrokken glas capillair. Verwijder de oude media die drijvende vrijstaande fibroblast cellen door aspireren. Wassen met hESC media (zonder bFGF) een keer. Voeg 3 ml / putje verse hESC media (zonder bFGF). Snijd de neurale-induced hESC kolonies in kleine stukjes, en maak met een steriele pipet tip of getrokken glas capillair. Het zwembad van het medium met vrijstaande kolonie stukken samen in een 50 ml conische buis. Ze wast de plaat met 1 ml / putje hESC media (zonder bFGF) en het zwembad bij elkaar. Aliquot 4 ml / putje serumvrij hESC media die kolonie stukken tot een 6-well Ultra-bevestigingsplaat en incuberen in een 37 ° C bevochtigde incubator te laten zweven cellulaire clusters (neuroblasts) te vormen voor de 4-5 dagen. 6. Neuronale Fenotype Rijping in Adhesive Cultuur Het zwembad van het media die drijvende neuroblasts samen in een 50 ml conische buis. Centrifugeer bij 1400 rpm gedurende 5 minuten. Aspireren van de oude media zo veel als je kunt en toevoegen gelijke hoeveelheid verse NSC media met VEGF (20 ng / ml), NT-3 (10 ng / ml), en BDNF (10 ng / ml). Pipet op en neer aan drijvende neuroblasts en aliquot mix 4 ml / goed op 6-well platen. De neuroblasts kan ook seeded in een laminine / collageen (Matrigel) of de menselijke laminine gepolymeriseerd 3-dimensionale matrix in serum-vrij NSC media met VEGF (20 ng / ml), NT-3 (10 ng / ml), en BDNF (10 ng / ml) . Overdracht van de platen om een ​​37 ° C bevochtigde incubator om neuroblasts te hechten 's nachts. Vervang de NSC media met VEGF (20 ng / ml), NT-3 (10 ng / ml), en BDNF (10 ng / ml) om de andere dag. Uitgebreide netwerken van neurieten-dragende neuronale cellen en gepigmenteerde cellen beginnen te verschijnen binnen twee weken van continue teelt en de toename van het aantal met de tijd, en kon worden volgehouden meer dan 3 maanden. 7. Representatieve resultaten: Retinoïnezuur (RA) is weergegeven voldoende is om hESC 's gehandhaafd in de gedefinieerde cultuur-systeem om de overgang van pluripotentie uitsluitend aan een neuro-ectodermale fenotype (Fig. 2A) veroorzaken. Bij blootstelling van ongedifferentieerde hESC 's tot RA, zullen alle cellen binnen de kolonie ondergaan morfologie van wijzigingen in degrote gedifferentieerde cellen die niet langer tot expressie pluripotentie-geassocieerde merkers, zoals aangegeven door okt-4, en beginnen uitdrukken diverse neuroectoderm-gerelateerde markers, zoals HNK1, AP2, en TrkC (Fig. 2B). Deze grote gedifferentieerde cellen zal blijven vermenigvuldigen en de kolonies zullen in omvang toenemen, uitgaande spontaan aan het begin van de neuronale marker β-III-tubuline (Fig. 2B) te drukken. De meer volwassen neuronale marker Kaart-2 zal beginnen te verschijnen in gebieden van de kolonies waar de cellen hebben opgestapeld (Fig. 2B). Samenvallend met het uiterlijk van de neuro-ectodermale cellen en neuronale differentiatie, zal de neuronale specifieke transcriptie factor Nurr1, betrokken bij dopaminerge neuronale differentiatie en activering van de tyrosine hydroxylase (TH)-gen 16, verplaatsen naar de kern (Fig. 2B). Na vrijstaand, zal de RA-behandelde hESC 's vorm drijvende cellulaire clusters (neuroblasts), in een suspensie culture naar de neurale differentiatie-proces voort te zetten. Na het verwijderen van bFGF en na het toelaat de neuroblasts te hechten aan een weefselkweek plaat of gezaaid in een laminine / collageen gepolymeriseerde 3-dimensionale matrix in een serum-vrij gedefinieerde medium, β-III-tubuline-en Kaart-2-expressie en neurieten -dragende cellen en gepigmenteerde cellen zullen beginnen te verschijnen met een drastische verhoging van de efficiency ten opzichte van spontane multi-lijn differentiatie van hESC 's zonder behandeling, over dezelfde periode, en kan worden volgehouden voor meer dan 3 maanden (Fig. 2C). Figuur 1 Een schema van goed gecontroleerde efficiënte inductie van menselijke pluripotente stamcellen uitsluitend aan een bepaald klinisch relevante lijn door een eenvoudige bepaling van kleine moleculen. Figuur 2 <strong> Retinoïnezuur veroorzaakt neurale afkomst specificatie en neuronale progressie direct van pluripotentie onder gedefinieerde omstandigheden. (A) Schematische voorstelling van het protocol de tijd lijn van gerichte neuronale differentiatie van hESC 's. (B) Bij blootstelling van ongedifferentieerde hESC 's aan retinoïnezuur (RA) onder de gedefinieerde cultuur, grote gedifferentieerde okt-4 (rood) negatieve cellen binnen de kolonie begon te ontstaan, in vergelijking met de mock-behandeld (DMSO) hESC' s als de controle- . RA-geïnduceerde gedifferentieerde Oct-4-negatieve cellen begonnen te uiten HNK-1 (rood), AP2 (rood), TrkC (groen), en dan β-III-tubuline (rood), consistent met vroege neuro-ectodermale differentiatie. Deze cellen bleven rijpen uiteindelijk de uiting van de neuronale marker Kaart-2 (groen), meestal in gebieden waar de cellen begonnen op te stapelen. Samenvallend met het uiterlijk van de neuro-ectodermale cellen en neuronale differentiatie, de neuronale specifieke transcriptie factor Nurr1 (groen), betrokken bijdopaminerge neuronale differentiatie en activering van de tyrosine hydroxylase (TH)-gen, translocatie naar de kern. Alle cellen worden getoond door DAPI kleuring van hun kernen (blauw). (C) behandeling van RA induceert de differentiatie naar een neuronale lijn met een hoge efficiëntie zoals beoordeeld door de uitgebreide netwerken van neurieten-dragende cellen die β-III-tubuline (rood) en Kaart-2 (groen, weergegeven in een drie-dimensionale matrix). Pijlen geven gepigmenteerde cellen typisch van die in het CZS. Alle cellen worden getoond door DAPI kleuring van hun kernen (blauw) in het inlegwerk. Schaal bars: 0,1 mm.