우리는 인간의 연결을 progenitors 및 신경 수리 개발 CNS에의 연결을 세포 유형의 대형 공급 파생을 가능하게 작은 분자와 함께 정의된 조건 하에서 유지 pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 직접 neuroblasts의 유도를위한 프로토콜을 설립했습니다.
수리 또는 손상된 중추 신경계의 재생 (CNS) 구조와 오늘날의 의료 산업에서 회로에 대한 임상 – 적합한 인간의 연결을 세포 소스에 대한 큰 이루어지지 않은 필요가있다. 세포 기반 요법은 CNS 장애에 대한 손실 신경 조직과 기능을 복원하는 큰 약속을 잡아. 그러나, CNS – 파생 신경 줄기 세포에 따라 세포 요법은 공급 제한 및 인한 광범위한 passaging 1-3 이후 문화와 실패 소성에서 제한된 확장 능력에 임상 설정에 사용하는 데 어려움이 발생했습니다. 일부 이익 결과에도 불구하고, CNS – 파생된 인간의 신경 줄기 세포 (hNSCs)는 내생 세포가 1-3 구조로 생산 영양과 neuroprotective 분자를 통해 주로 자신 이외의 연결을 progenies함으로써 치료 효과를 발휘하기 위해 나타납니다. supplyin에 의해 신경 질환의 광범위한 양자 택일로, pluripotent 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)는 proffer의 치료g 중생 1,4-7에 대한 개발 CNS 인간의 연결을 세포 유형의 다양성. 그러나, 원하는 표현형에 효율적이고 예측할 수 pluripotent hESCs의 다양한 차별의 가능성을 채널하는 방법을 개발 연구와 임상 번역 모두에 큰 도전을했습니다. 종래의 접근 방식은 종종 phenotypic 이질과 불안정, 따라서, tumorigenicity 7-10 높은 위험을 따라 비효율적과 지나치게 혈통 – 노력의 결과로, 자연 배아 계층 분화를 통해 pluripotent 세포의 멀티 혈통 기울기에 의존하고 있습니다. 또한, 정의되지 않은 외국인 / 동물 생물 학적 보조 및 / 또는 일반적으로 격리, 확장, 그리고 hESCs의 분화에 사용되었습니다 모이통는 11-13 문제 환자에서 이러한 세포 이식 전문 직접 사용할 수 있습니다. 이러한 장애물을 극복하기 위해, 우리는 필요한 s에 대한 충분한 정의된 문화 시스템의 요소를 해결임상 – 적절한 hESCs의 드 노보 유도를위한 플랫폼으로 제공, hESCs의 epiblast의 pluripotence을 ustaining하고 효과적으로 작은 분자 14 (그림 설계도를 참조하시기 바랍니다. 1)에 의해 임상 – 관련 lineages으로 균일하게 같은 hESCs을 지휘. Retinoic 산 (RA)는 모이통 1, 14 일 유지 undifferentiated hESCs의 분화를 유도의 연결하지 않습니다. 그리고 마우스 ESCs와는 달리, hESC – 차별화 embryoid기구 (EBS)을 치료 것은 약간 뉴런 1, 14, 15의 낮은 수확량을 증가시킵니다. 그러나, 작은 분자 및 성장 요인의 다양한 상영 후, 우리는 이러한 정의 조건이 더 이상 인간의 연결을 progenitors과에서 뉴런을 생성 neuroblasts로 진행 pluripotent hESCs에서 직접 neuroectoderm의 사양을 유발하는 retinoic 산성 (RA)가 충분한 렌더링 발견 고효율 발전 CNS (그림 2). 우리는 신경의 유도에 대한 조건을 정의세포 기반 치료제에 대한 개발 단계의 스펙트럼에 걸쳐 인간의 연결을 세포의 대형 공급 잘 제어 효율적인 파생을 가능하게 개입 멀티 혈통 embryoid 바디 단계없이 pluripotent hESCs에서 직접 폭발.
발달 연구와 임상 번역 모두의 주요 과제 중 하나는 효율적이고 예측할 원하는 표현형에 pluripotent 인간 줄기 세포의 광범위한 차별 잠재력을 채널로하는 방법되었습니다. 이러한 세포가 여러 혈통 골재 단계를 통해 이동하여 모든 세균 레이어의 세포로 체외에서 자발적으로 구별 수 있지만, 세포의 작은 파편만이 주어진 계보 (Lineage) 1,4을 추구. 그 hESC – 파생 집계에서 삼배 배아 레이어에있는 수 광범위하게 분기하는 원치 않는 세포 유형의 상당한 금액의 동시 모습은 종종 비효율뿐만 아니라 원하는 phenotypes의 출현을 만드는,하지만 통제하고 신뢰할 수뿐만 아니라. 심장과 신경 lineages는 이전 보고서에서 파생되어 있지만, 그러나, pluripotent 세포의 세균 레이어 유도 및 tumorigenicity의 높은 위험을 통해 전문적인 세포를 생성하는 비효율이 transplantatio에 따라n은 추가 임상 번역을 방해했습니다.
hESC 라인은 초기 성장 체포 마우스 배아 섬유아 세포 (MEFs) 4 파생된 및 공동 문화 유지했다. 여러 인간 피더, 피더 – 무료 및 화학적 – 조제 문화 시스템 hESCs 11-13을 위해 개발되었습니다지만 필요하고 인간 pluripotent 세포의 자기 갱신을 유지에 충분한 요소가 미해결 상태로 유지됩니다. 이러한 외인성 피더 세포 및 생물 학적 시약은 마스크 반면에 발달 신호에 응답하는 pluripotent 세포의 능력을 undifferentiated hESCs의 장기적인 안정 성장을 유지할 수 있도록 도와주십시오. 성실 확장 및 관리할 수있는 직접적인 차별을 허용하는 정의 biologics 무료 문화 시스템에 undifferentiated hESCs을 유지하는 것은 자신의 치료 유틸리티와 가능성의 열쇠 중 하나입니다. RA는 이전에 보고된 condit 이하 유지 undifferentiated hESCs의의 연결을 분화를 유도하기 위해 충분한 아니었외인성 피더 세포를 포함하는 이온. 신경 lineages는 RA와 hESC – 차별화된 멀티 혈통 집계를 (embryoid 기관) 치료, hESC의 차별화에 상대적으로 초기 단계에 나타납니다 있지만 약간 뉴런 1, 14, 15의 낮은 수확량을 증가했습니다. 특정 혈통에 인간의 pluripotent 줄기 세포의 일정한 변환을 달성하기 위해, 우리는 임상 – 관련 혈통 특정에 독점적으로 pluripotent의 hESCs의 잘 제어 효율 유도 조건을 식별하는 undifferentiated hESCs의 확산을 할려고 수있는 정의된 문화 시스템을 채용 작은 분자의 단순한 제공 (그림 1, 그림. 2). 미래 연구는 재생 요법에 대한 임상 – 관련 lineages를 파생하면 hESC의 pluripotent 운명의 작은 분자 중재 직접 제어 및 모듈 레이션을위한 방법을 포장 수있는, 대안으로 인간 CNS 개발 유전 및 epigenetic 조절 분자를 보여줄 것입니다. RA 치료, 1-5없이%의 hESCs는 뉴런 1, 14, 15으로 자발적인 차별을 받아야합니다. RA 치료와 함께, 우리는 인간의 배아 발달 14 에뮬레이트 수도 과정에서 정의하는 문화에 따라 유지 hESCs에서> 95% 배아의 연결 progenitors과 뉴런을 생성할 수있게되었습니다. 최근 유전자를 결정 알려진 신경 운명은 0.5-8 % 17, 18까지 낮은 효율 성인 신경 progenitors과 뉴런에 마우스 섬유아 세포를 transdifferentiate하는 데 사용되었습니다. 그러나, 다시 프로그램 체세포 역사적으로 비정상적인 유전자 발현 및 장애 치료 유틸리티를 19-21로 가속 노화와 관련된되었습니다. 마지막으로, 우리가 여기 설립 프로토콜, 내부 세포 덩어리 (ICM) 또는 인간 blastocyst 4 epiblast에서 파생된 pluripotent hESCs로 제한됩니다는 morula 이전에서 파생 동물 – 기원 ESCs, ESCs (8 등 다른 pluripotent 세포에 적용되지 않을 수도 있습니다 세포) 단계 배아 22, 그리고 인형도 만들고icially 다시 프로그램 세포 23.
The authors have nothing to disclose.
XHP은 노화에 국립 연구소 (NIHK01AG024496)와 아동 건강 및 인간 발달의 유니스 케네디 Shriver 국립 연구소 (NIHR21HD056530)에서 건강 (NIH) 보조금의 국립 연구소에 의해 지원되었습니다.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Gelatin | Sigma | G1890 | |
Matrigel | BD bioscience | 356231 | Growth factor reduced |
Human laminin | Sigma | L6274 | |
all-trans-Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
DMEM/F12 | Invitrogen | 10565018 | |
DMEM | Invitrogen | 31053036 | |
DMEM-KO | Invitrogen | 10829018 | |
Knock-out serum replacement | Invitrogen | 10828028 | |
MEM nonessential amino acid solution (MNAA, 100X) | Invitrogen | 11140050 | |
MEM amino acids solution (MEAA, 100X) | Invitrogen | 11130050 | |
β-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985023 | |
Albumax | Invitrogen | 11020021 | |
Ascorbic acid | Sigma | A4403 | |
Human transferrin | Sigma | T8158 | |
Human bFGF | PeproTech | AF-100-18B | |
Human insulin | Invitrogen | 12585014 | |
Human activin A | PeproTech | 120-14E | |
Human BDNF | PeproTech | AF-450-02 | |
Human VEGF | PeproTech | AF-100-20 | |
Human NT-3 | PeproTech | 450-03 | |
Heparin | Sigma | H5284 | |
N-2 supplement (100X) | Invitrogen | 17502048 | |
6-well ultralow attachment plate | Corning | 3471 | |
6-well plate | Corning | 3516 |