人类神经祖细胞和神经元小分子诱导人类胚胎干细胞的多能干高效的推导

1。解决方案和媒体准备明胶涂层解决方案：0.1％（W / V），蒸压在DDH 2 O的明胶和储存于4 ° C。 基质胶涂层解决方案。联合解决方案：缓慢解冻基质胶（10毫升）于4 ° C过夜，加10毫升冰冷的DMEM或DMEM/F12，拌匀等分1毫升/管消毒的组织文化引擎盖底下，储存在-20 ° C.工作液：缓慢解冻1毫升基质胶分装在4 ° C 1-2小时，转移到14毫升冷冻的DMEM或DMEM/F12，拌匀涂装前消毒的组织文化引擎盖下方。 人层粘连蛋白涂层解决方案：稀释1毫升人类层粘连蛋白溶液（0.5毫克/毫升的Tris缓冲盐，储存在-80℃，在4 ° C缓慢解冻1-2小时），用冰冷的DMEM或DMEM/F12到12.5毫升工作液（40微克/毫升）消毒的组织文化引擎盖下方紧接涂层。 生长因子库存解决方案（500 – 1000X）：溶解在10微克生长因子/ ml的消毒缓冲（0.5％BSA，1.0毫米的数码地面电视，10％甘油，1XPBS）和存储50-100μL/管分装在-80 ° C 全反式维甲酸溶液（1000X）：10 -80毫米，分装店在DMSO ° C。 HESC媒体的DMEM/F12或Ko – DMEM（80％），KO血清替代（20％），L -丙氨酰- L -谷氨酰胺和L -谷氨酰胺（2毫米），纪念不必要的氨基酸（MNAA 1X），并β-巯基乙醇（100微米），过滤和储存于4 ° C，使用前20毫微克/毫升碱性成纤维细胞生长因子的补充。或更换“击倒（KO）的血清替代品”的DMEM/F12或KO – DMEM（100％），L -丙氨酰- L – GLN或L -谷氨酰胺（2毫米），MNAA（1X），纪念必不可少的定义组件：氨基酸（MEAA 1X），和β-巯基乙醇（100μM），过滤和储存在4 ° C，碱性成纤维细胞生长因子（20毫微克/毫升），人胰岛素（20微克/毫升），抗坏血酸（50微克/为辅毫升），人类激活素A（50毫微克/毫升），人血白蛋白/ Albumax（10毫克/毫升），和人转（8微克/毫升），使用前。 国科会媒体：DMEM/F12（100％），N – 2个supplemeNT（1X），肝素（8微克/毫升）。 2。板的涂层涂层板明胶：添加2.5毫升/明胶溶液6孔板，在37 ° C培养箱孵育过夜。 涂层板与层粘连蛋白：寒意明胶涂层钢板和删除明胶，添加2.5毫升/良好的基质胶或人类的层粘连蛋白涂层工作方案预冷糊化6孔板孵育在4 ° C过夜。 3。在规定条件下未分化的人类胚胎干细胞的传代和播种允许人类胚胎干细胞菌落生长到5-7天左右，并采取胚胎干细胞培养板，解剖显微镜（剖析阶段预温至37 ° C）下方解剖消毒罩。 选择被分裂的胚胎干细胞菌落。形态上，这些殖民地应该有定义的边缘联合国> 75％，未分化的人类胚胎干细胞（小型紧凑细胞），通常稍不透明的（不是白堆砌的细胞，没有明确的分化细胞）derneath解剖显微镜。小心地勾勒出选定的殖民地和删除分化成纤维细胞层周围的殖民地和所有有区别的部分（如果任何殖民地）与P2的无菌枪头边缘拉玻璃毛细管。 （请注意，多能胚胎干细胞是在瞬态阶段，经历即使在最佳条件下自发分化，虽然首选，它的难以细胞确定论文100％无差别解剖显微镜下，> 75％的未分化是通常的传递点考虑。“分化的细胞通常不会种子和持续增长，在传代过程中被淘汰） 取下吸浮动分离分化的细胞含有的旧媒体。人类胚胎干细胞介质（无碱性成纤维细胞生长因子），一次洗干净。加入3毫升/以及含有20 ng / ml的碱性成纤维细胞生长因子的新鲜胚胎干细胞媒体。 切成小块的未分化的胚胎干细胞菌落，用无菌枪头或拉玻璃毛细管和分离。池媒体中含有50毫升的锥形管分离的殖民地拼凑。洗板一次1毫升/人类胚胎干细胞以及媒体含有20毫微克/毫升碱性成纤维细胞生长因子和池一起。 吸新鲜的涂层板的基质胶或人类的层粘连蛋白溶液。分装4毫升/包含殖民地件以及人类胚胎干细胞媒体6孔板。轻轻板转移到孵化器，无晃动，让殖民地件的种子没有令人不安的气氛中5％的CO 2，饱和湿度37℃培养箱过夜。 4。文化系统定义维甲酸诱导下的人类胚胎干细胞神经在播种后第3天，从每个板块以及删除最旧的媒体和留下足够的媒体，让人类胚胎干细胞的殖民地被淹没（决不允许人类胚胎干细胞向干出）。更换4毫升/新鲜胚胎干细胞含有20 ng / ml的碱性成纤维细胞生长因子和10微米维甲酸的媒体。 替换旧媒体与新鲜胚胎干细胞含有20 ng / ml的碱性成纤维细胞生长因子和媒体10μM维甲酸隔日，并让神经诱导人类胚胎干细胞的菌落长到7或8天。殖民地内的所有细胞将发生大分化的细胞，继续繁殖的形态变化。殖民地的大小会增加，以涵盖7天或8板，细胞就会开始堆积在一些地区的殖民地。 5。悬浮培养持续神经元分化以人类胚胎干细胞培养板解剖显微镜消毒罩下面剖析（剖析阶段预温至37 ° C）。小心地勾勒出殖民地和成纤维细胞层周围的殖民地（分化的细胞迁移的殖民地）与P2的无菌枪头边缘删除或拉玻璃毛细管。 取下吸浮动分离的成纤维细胞中含有的旧媒体。人类胚胎干细胞介质（无碱性成纤维细胞生长因子），一次洗干净。加入3毫升/以及新鲜的人类胚胎干细胞介质（无碱性成纤维细胞生长因子）。 剪下的神经- Induced人类胚胎干细胞成小块殖民地，并用无菌枪头分离或拉玻璃毛细管。 池媒体中含有50毫升的锥形管分离的殖民地拼凑。洗板一次1毫升/以及人类胚胎干细胞介质（无碱性成纤维细胞生长因子）和汇集。 分装4毫升/无血清胚胎干细胞媒体殖民地件含有6以及超低附件板和孵化在37 °彗星培养箱允许浮动（神经母细胞）细胞集群，形成4-5天。 6。胶粘剂文化中的神经细胞表型成熟池媒体浮动神经母细胞含有50毫升的锥形管。在5分钟1400转的离心机。吸，你可以旧媒体和含血管内皮生长因子（20毫微克/毫升），NT – 3（10毫微克/毫升），并BDNF（10纳克/毫升），加等量新鲜国科会媒体。 移液器上下混合浮动的神经母细胞和分装4毫升/ 6孔板。也可以本身的神经母细胞在一个层粘连蛋白/胶原（基质胶）或人类的层粘连蛋白聚合的三维矩阵​​含有血管内皮生长因子（20毫微克/毫升），NT – 3（10毫微克/毫升）和BDNF（10毫微克/毫升）在无血清的国科会媒体eded 。板块转移到了37 °彗星培养箱，让神经母细胞附加过夜。 更换NSC媒体含有血管内皮生长因子（20毫微克/毫升），NT – 3（10毫微克/毫升），和BDNF（10毫微克/毫升），隔日。含突起的神经元细胞和色素细胞的广泛的网络将随着时间的数字不断培育和增加2个星期内开始出现，并可以持续3个月以上。 7。代表性的成果： 维甲酸（RA）呈现足以吸引从多能性维持在定义文化系统过渡的人类胚胎干细胞向神经外胚层表型（ 图 2A）独家。 RA未分化的人类胚胎干细胞的暴露后，殖民地内的所有细胞进行形态学变化- 4月，大分化的细胞停止表达多能性相关的标记，并开始表达神经外胚层相关的各种标志物，如HNK1，AP2，和TrkC（ 图2B） 。这些大分化的细胞会继续繁殖和殖民地将扩大规模，进行自发地表达早期神经元的标记β- III -微管蛋白（ 图 2B ）。更加成熟的神经元标记MAP – 2细胞越积越多（ 图 2B）菌落地区将开始出现。与外观的神经外胚层细胞和神经细胞的分化重合，神经元特异性转录因子NURR1，多巴胺能神经元分化和激活的酪氨酸羟化酶（TH） 基因 16牵连，将转运到细胞核内（ 图2B） 。 RA的治疗的胚胎干细胞分离后，将形成漂浮在悬浮邪教的细胞簇（神经母细胞）URE继续进行神经分化过程中。碱性成纤维细胞生长因子去除后允许附加到一个组织培养板或在层粘蛋白/胶原聚合3维矩阵接种于无血清定义介质，β三，微管蛋白和地图- 2表达，突起的神经母细胞后，含细胞和色素细胞就会开始出现大幅增加，自发的多系分化的人类胚胎干细胞治疗不超过同一时期相比，在效率，并可以持续超过3个月（图2C）。 图1控制专门为特定的临床相关的宗族提供简单的小分子的高效诱导人类多能干细胞的示意图。 图2 <stro吴>维甲酸诱导神经谱系规范和神经细胞的全能性在规定条件下直接的进展（ 一 ）原理图描绘的人类胚胎干细胞定向神经分化的协议的时间线。 （b）在未分化的人类胚胎干细胞暴露在维甲酸（RA）的定义的文化系统，大的区别的Oct – 4的殖民地内（红色）阴性细胞开始出现，如模拟处理（DMSO）为控制人类胚胎干细胞相比。 RA诱导差异10月4负的细胞开始表达HNK – 1（红色），AP2（红色），TrkC（绿色），然后β- III -微管蛋白（红色），与早期神经外胚层分化一致。这些细胞不断走向成熟，最终表达神经元标记MAP – 2（绿色），通常在细胞开始堆积的地方，。与外观的神经外胚层细胞和神经细胞的分化重合，神经元特异性转录因子NURR1（绿色），牵连多巴胺能神经元分化和激活的酪氨酸羟化酶（TH）基因，易位到细胞核。所有细胞都表现出其原​​子核的DAPI染色（蓝色）。 （三）治疗RA诱导突起轴承细胞表达β-Ⅲ-微管蛋白（红色）和MAP – 2（绿色显示，在3二维矩阵）的广泛网络评估朝着高效率的神经细胞谱系分化。箭头指示的色素细胞在中枢神经系统的典型。所有细胞都表现出其原​​子核中的insets DAPI染色（蓝色）。比例尺：0.1毫米。