Rat pial arteriollerde Östrojen Reseptör-α Dijital Immunofluorescent Mikroskobu kullanılarak görüntülenmesi

Daha önce, geçici global iskemik beyin hasarı sonrası vazodilatörler ^{7, 8} ve vazokonstriktörlere ⁹ yanıt olarak çapını değiştirmek için pial arter kapasitesi belirgin genç ovarektomize sıçanlarda depresif olduğunu gösterdi. Kronik östrojen replasmanı vazomotor yanıtları ^7-9 geri yükler. Ayrıca, östrojen replasman gecikme, bize uzun süreli östrojen eksikliği cerebrovasculature ER-α yoğunluğu etkileyip etkilemediğini sorgulamaya yol açan pial arter vazodilatör ^kapasitesi 10 östrojen yararlı etkilerini tersine çevirir . Biz batı kronik östrojen tükenmesi yanıt ER-α ifade değişiklikleri değerlendirmek için blot ile birlikte immunofluorescent etiketleme kullanılması planlandı. Reseptörleri ayrık gruplar görselleştirme bazı zorluk vardı Çünkü biz burada göstermek yöntemi değiştirilebilir. Bu nedenle, bu çalışmada birincil hedefimiz ilk görsel optimize etmek için nispeten basit bir yöntem geliştirmek içinpial arteriollerde reseptörleri Ag + referans. Çeşitli raporlar ile anlaşma ^6,11,12 biz problama doku tipi için ayarlamalar, örnek kalınlığı, gemi ER-α dağılımı yanı sıra non-spesifik bağlayıcı derecesi yapmak için gerekli bulundu. .

Bizim metodumuz pial gemi dilimleri ER-α varlığı görselleştirmek için çok etkili. Ancak diğerleri bu yöntemlerin başarılı kullanımı, daha önce belirttiğimiz gibi antikorların özgüllük ve konsantrasyonları, faiz, fiksasyon ve engelleme protokolleri ve doku taşıma ¹² proteinlerin hücre içi konumu son derece bağlıdır. Geminin hazırlıkları görselleştirme önce biz tüm bu değişkenler zaman geçirdim. Biz nasıl biz bu yazıda bazı yaklaşım ayarlamak için gerekli sermiştir.

Optimal pial arteriyollerin ER-α görselleştirmek için yola çıkan ve bu birkaç zorluklar sundu.Birincisi, bir sıçan pial arter ortalama büyüklüğü 35-50 mikron arasında beyin yüzeyinden izolasyon ve çıkarılması biraz zor. Biz Evans mavi boya öncesi kurban etmek daha kolay damar diseksiyonu yapar perfüzyon bulundu. Evan mavi floresan etkileyebilir, ancak biz bu boya kullanılarak avantajı küçük dezavantajları fazla olduğunu hissediyorum. Protokolde gemilerin birkaç kez yıkanır. Bu gemilerin içinde kalan boya ve floresan boya olası etkilerini en aza indirir azaltır. Karşılaştığımız bir diğer zorluk pial damar segmentlerinin kalınlığı zor reseptörler açık görselleştirme yapılmış olmasıydı. Ayrıca, muhtemelen birçok hücre katmanları ER-α dağılmış olduğu gerçeğini nedeniyle, özellikle net görüntüler elde edemezler. Uzunlamasına damar dilimleri (diğerleri gibi) ile çalışan çalıştı, ancak montaj sırasında küçük pial boyutu nedeniyle gemilerin işlemek ve gemilerin sıkılmasını önlemek zorduhatta bir mikroskop kullanılarak slides on. Son olarak, başarılı bir Kriyostat kullanarak ve 8 mikron kalınlığında halkalar çapraz damar kesme tekniği değiştirilmiş. Halkalar kolay ve çeşitli bir slayt monte edilebilir.

Bir kere biz, biz sonra gemilerin tespit Danseshatalb ve ^ark 11 tarafından önerilen doku dondurma ilk flaş etkinliğini test etmek üzere gerekli hissettim gemilerin satın aldı . Marjinal olarak daha az arka plan immünofloresan rağmen, biz de reseptörleri daha az yoğun görselleştirme reseptörlerinin daha zor hale boyanmış olduğunu kaydetti. Sonuç olarak, (genellikle 1-2 ay arasında) kadar gerekli tüm beyin dondurmak ve saklamak için ilk tercih. Daha sonra gemilerin açıklandığı gibi çekin ve gemilerin Kriyostat dilimleme önce düzeltmek. Burada göstermek gibi.

Bir birincil ve ikincil antikor ayrı ayrı hem de denetimlerini çalıştırmak için gerekli bir adımözgüllük ve arka plan immünofloresan belirlemek için. Östrojen reseptör-α antikorları ile çalışmak zor olabilir. Reseptör boyanması başarı ile memnun önce Aslında, biz 3 farklı birincil antikorlar (1 monoklonal ve poliklonal 2) çalıştı. Kontrollerin bir parçası olarak, öncelikle birincil antikor yanı sıra ihmal birincil antikor özgüllük doğrulandı. Şekil 2D primer antikor olmadan geminin gösterir. Herhangi bir boyama ve sadece küçük bir arka plan sinyali vardır. Birincil antikor poliklonal olduğundan, bazı diffüz non-spesifik bir arka plan boyama vardır. İkincisi, biz birincil antikor eklendi, ancak ikincil antikor (Şekil 2E). Bir damarların endotel sınırları boyunca autofluoresence temsil eden güzel bir marj görebilirsiniz. Bu çalışma ile Dan ve iştirakçi ⁵ tutarlı. Ancak, ER-α temsil immünofloresan küçük noktaların, ne de granüler bir görünüm ref nesayısız reseptörlerinin varlığı lecting birincil ve ikincil antikorlar hem de birleşimi olmadan tespit edilebilir. Biz farklı bir desen damarların endotel kenarları boyunca autofluoresence kaydetti. ER-α antikor özgüllük onaylamak ve ikincil antikor birincil bağlar antikor özgüllük Bu bağımsız testler önemlidir.

Sonuç olarak, diğerleri ⁴ gösterdiği ^{gibi, 5} beyin kan damarları çok sayıda ER-α alt-tipi reseptörler içerir . Bizim ellerde, izole pial arterlerden 8μm kesit dilimleri hazırlanıyor reseptörlerinin boyama ve görselleştirme artırır. Geleneksel yöntemler örnekleri incelemek konfokal mikroskopi kullanın. Konfokal mikroskopi kalın kesitlerle seri optik bölümleri görüntülemek için kapasitesine sahip önemli bir yararı. Ancak, iyi bir konfokal mikroskop satın alma, çok pahalı olabilir. Genişletilmiş Derinlik (EDF) yazılımı kullanılarak, biz bulundu.ekipman maliyetleri azaltabilir. EDF ile floresan mikroskop kullanarak, net görüntüler elde edilir ve Z-yığınları kullanarak çeşitli düzeylerde pial arteriyel ER-α görselleştirmek mümkün. EDF yazılım önemli bir yararı, bir şekilde etkili görüntüleri 3 boyutlu bir resim oluşturmak için görüntü yakalama izin verir. Konfokal mikroskop ya da fonların bir tahsis yazılımı ile dijital floresan mikroskop satın almak için erişimi olmayan laboratuarlar için araştırmacının hedeflerine bağlı olarak pratik ve daha az maliyetli bir seçenek olabilir.