Визуализация эстрогеновых рецепторов-α в Крыса пиальных Артериолы использованием цифровой микроскоп иммунофлуоресцентного

Ранее мы показали, что после переходного глобального ишемического повреждения мозга пиальных мощность артерии изменять диаметр в ответ как вазодилататоры ^{7, 8} и ⁹ вазоконстрикторов заметно депрессии у молодых крыс с удаленными яичниками. Хронический пресыщения эстрогенов восстанавливает вазомоторных ответов ^7-9. Кроме того, задержка замены эстрогена меняет положительное влияние эстрогенов на мягкой мозговой оболочки артерии сосудорасширяющее мощностью ¹⁰ ведущих нас вопрос о том, долгосрочных эстроген влияет на истощение ER-α плотности в cerebrovasculature. Мы планировали использовать иммунофлуоресцентного маркировка в сочетании с западной промокательной для оценки изменений в ER-α выражение в ответ на хроническое истощение эстрогена. Потому что у нас были некоторые трудности в визуализации дискретных групп рецепторов мы модифицировали метод, который мы демонстрируем здесь. Таким образом, наша основная задача в данном исследовании было сначала разработать относительно простой метод для оптимизации визуальныхзации рецепторов в пиальных артериол. По договоренности с несколькими отчетами ^6,11,12 мы сочли необходимым внести коррективы для данного типа ткани мы зондирования толщины образца, распределение ER-α в сосуде, а также степень неспецифического связывания .

Наш метод очень эффективен для визуализации присутствие ER-α в пиальных ломтиками судна. Но, как другие уже было отмечено успешное использование этих методов во многом зависит от специфики и концентрации антител, внутриклеточной локализации белков интереса, фиксации и блокирование протоколов и обработке тканей ^12. До визуализации наших препаратов судна мы провели время, чтобы отработать все эти переменные. Мы выявили, как мы, необходимых для корректировки некоторых наших подход в данной работе.

Мы задались целью оптимально визуализировать ER-α в пиальных артериол и это представлено несколько задач.Во-первых, средний размер крысы пиальных артерии между 35-50 мкм решений изоляции и удаления с поверхности мозга несколько сложнее. Мы обнаружили, что перфузии с Эванса синего красителя до жертву делает вскрытие артерии легче. Синий Эван может влиять флуоресценции, но мы чувствуем, что преимуществом использования этого красителя перевешивают ее незначительные недостатки. В нашем протоколе суда промывают несколько раз. Это сводит к минимуму остаточные красителя в сосуды и уменьшает возможные последствия красителя на флуоресценцию. Еще одна трудность, мы столкнулись, был, что толщина пиальных сегментов судно ясно визуализации рецепторов сложно. Кроме того, мы не могли получить четкое изображение в частности, вероятно, связано с тем, что ER-α была разбросана на протяжении нескольких слоев клеток. Мы старались работать с продольными ломтиками судна (как и другие), но из-за небольшого размера пиальных было трудно справиться сосуды и предотвратить скручивание судов при монтажена слайдах даже с помощью микроскопа. Наконец, мы успешно модифицировать нашу технику с помощью криостата и резки судна крест-накрест в до 8 мкм колец. Кольца более просты в обращении и несколько может быть установлен на одном слайде.

После того как мы приобрели судов мы сочли необходимым проверить эффективность первой вспышки замораживания тканей затем фиксация суда как это было предложено Danseshatalb и партнеров ^11. Хотя мы обнаружили, незначительно меньше фонового иммунофлюоресценции, мы также отметили, что рецепторы менее интенсивно окрашенных решений визуализации рецепторов сложнее. Следовательно, мы предпочитаем первый заморозить весь мозг и хранить до необходимости (как правило, от 1-2 месяцев). Затем снять судов, как это описано и исправить судов до нарезки с криостата. как мы демонстрируем здесь.

Необходимым шагом является запуск контроля как с первичными и вторичными антителами отдельноопределить специфику и фоновые иммунофлюоресценции. Эстроген-рецептор α антитела могут быть трудно работать. На самом деле, мы старались 3 различных первичных антител (1 моноклональных и поликлональных 2), прежде чем мы остались довольны успех наших рецепторов окрашивания. Как часть нашего управления мы сначала проверить специфики первичного антитела на бездействие добавления первичного антитела. Рис 2D показывает судна без первичных антител. Существует не окрашивание и немного фонового сигнала. Так как первичные антитела поликлональные, есть некоторые диффузные неспецифические фоне окрашивание. Во-вторых, мы добавили первичных антител, но не вторичными антителами (рис. 2Е). Видно, хороший запас представляющих autofluoresence вдоль границы эндотелия сосудов. Это согласуется с работой Дана и партнеров ^5. Однако, ни маленьких точек иммунофлюоресценции, которые представляют ER-α, ни ссылка гранулированный видсобирая присутствии многочисленных рецепторов могут быть обнаружены без сочетания первичных и вторичных антител. Мы отметили, различные структуры autofluoresence вдоль эндотелия кулуарах суда. Эти независимые тесты на антитела специфики важны, поскольку они подтверждают специфичность антител для ER-α и вторичные антитела связываются с первичным.

В заключение, о чем свидетельствуют другие ^{4, 5} сосудов головного мозга кровью содержат многочисленные ER-α подтип рецепторов. В наших руках, готовя 8 мкм поперечного сечения ломтики из изолированных пиальных артерий повышает окрашивания и визуализации рецепторов. Традиционные методы использования конфокальной микроскопии для изучения образцов. Имея возможность просмотра серийного оптических срезов из толстых образцов важным преимуществом конфокальной микроскопии. Тем не менее, приобретение хорошей конфокальной микроскопии могут быть очень дорогими. С помощью расширенных Глубина (EDF) программного обеспечения, мы обнаружили, чтосможем сократить наши затраты на оборудование. Использование флуоресцентного микроскопа с EDF мы получили четкое изображение и способны визуализировать пиальных артериальной ER-α на нескольких уровнях с использованием Z-стеки. Значительные преимущества программного обеспечения EDF является то, что она позволяет захватывать изображение таким образом, чтобы эффективно создавать 3-D картинки из изображений. Для лабораторий, которые не имеют доступа к конфокальной микроскопии или средств на приобретение один цифровой флуоресцентный микроскоп с присвоили программное обеспечение может быть практичным и менее дорогостоящим вариантом в зависимости от целей исследователя.