Imaging del recettore dell'estrogeno α in Rat Arteriole Pial utilizzando un microscopio digitale immunofluorescenza

In precedenza, abbiamo dimostrato che dopo la lesione transitoria globale cerebrale ischemico dell'arteria piale la capacità di cambiare diametro in risposta ad entrambi vasodilatatori ^{7, 8} e ⁹ è vasocostrittori marcatamente depressa nei giovani ratti ovariectomizzati. Replezione estrogeni cronica ripristina risposte vasomotorie ^7-9. Inoltre, la sostituzione degli estrogeni ritardato inverte gli effetti benefici degli estrogeni sulla capacità di vasodilatazione delle arterie piale ¹⁰ che ci porta a chiedersi se a lungo termine l'esaurimento degli estrogeni colpisce ER-α densità nel cerebrovasculature. Abbiamo pianificato di utilizzare l'etichettatura immunofluorescenza combinata con western blotting per valutare le variazioni ER-α espressione in risposta a esaurimento estrogeni cronica. Perché abbiamo avuto qualche difficoltà nella visualizzazione di gruppi distinti di recettori abbiamo modificato il metodo che noi dimostriamo qui. Pertanto, il nostro obiettivo primario in questo studio era quello di sviluppare prima un metodo relativamente semplice per ottimizzare la visualezazione dei recettori nelle arteriole piale. In accordo con diversi rapporti ^6,11,12 abbiamo ritenuto necessario per effettuare le regolazioni per il tipo di tessuto siamo stati sondaggio, lo spessore del campione, la distribuzione di ER-α nel serbatoio, così come il grado di legame non specifico .

Il nostro metodo è molto efficace per visualizzare la presenza di ER-α a fette nave piale. Ma, come altri hanno già sottolineato il successo nell'uso di questi metodi è altamente dipendente dalla specificità e le concentrazioni degli anticorpi, la posizione subcellulare delle proteine ​​di interesse, fissazione e protocolli di blocco e la manipolazione dei tessuti ^12. Prima di visualizzazione dei nostri preparativi nave abbiamo trascorso il tempo di elaborare tutte queste variabili. Abbiamo evidenziato come abbiamo bisogno di regolare alcuni del nostro approccio in questo documento.

Abbiamo deciso di visualizzare in modo ottimale ER-α nelle arteriole piale e questo ha presentato alcune sfide.In primo luogo, la dimensione media di un'arteria ratto piale è compresa tra 35-50 micron rendendo l'isolamento e la rimozione dalla superficie del cervello un po 'difficile. Abbiamo scoperto che la perfusione con Evans colorante blu prima del sacrificio rende dissezione delle arterie più facile. Blu di Evan possono influenzare la fluorescenza, ma riteniamo che il vantaggio di utilizzare questo colorante superano gli svantaggi minori. Nel nostro protocollo i vasi vengono lavati più volte. Questo riduce al minimo il colorante residuo nei vasi e riduce i possibili effetti del colorante sulla fluorescenza. Un'altra difficoltà che abbiamo incontrato era che lo spessore dei segmenti nave piale reso chiara visualizzazione dei recettori difficile. Inoltre, non siamo riusciti a ottenere immagini particolarmente chiare, probabilmente dovuto al fatto che la ER-α era sparso per tutta strati di cellule diverse. Abbiamo provato a lavorare con fette vaso longitudinale (come altri hanno), ma a causa delle piccole dimensioni piale era difficile da gestire e prevenire i vasi torsione dei vasi durante il montaggiosu diapositive anche utilizzando un microscopio. Infine, siamo riusciti a modificare la nostra tecnica utilizzando un criostato e il taglio della nave trasversale in 8 anelli di micron di spessore. Gli anelli sono più facili da gestire e diverse possono essere montate su una diapositiva.

Una volta che abbiamo acquisito i vasi abbiamo sentito la necessità di testare l'efficacia del primo flash congelamento del tessuto poi fissa i vasi come suggerito da Danseshatalb e collaboratori ^11. Anche se abbiamo trovato immunofluorescenza sfondo leggermente meno, abbiamo anche notato che i recettori colorati meno intensamente rendendo la visualizzazione dei recettori più difficile. Di conseguenza, preferiamo prima di congelare l'intero cervello e immagazzinare fino al momento (generalmente compresa tra 1-2 mesi). Abbiamo poi tirare fuori i vasi, come descritto e fissare i vasi prima di affettare con il criostato. come abbiamo dimostrato qui.

Un passo necessario è quello di eseguire i controlli sia con il primario e l'anticorpo secondario separatamenteper determinare la specificità e l'immunofluorescenza sfondo. Recettore α-anticorpi possono essere difficili da lavorare. In effetti, abbiamo provato tre diversi anticorpi primari (1 e 2 monoclonale policlonali) prima eravamo soddisfatti del successo della nostra colorazione recettore. Come parte dei nostri controlli abbiamo prima verificato la specificità dell'anticorpo primario per omissione l'aggiunta dell'anticorpo primario. La figura 2D mostra la nave senza anticorpo primario. Non ci sono macchie e solo un segnale po 'di storia. Dal momento che l'anticorpo primario è policlonale, vi è una certa diffusa non specifica colorazione di fondo. In secondo luogo, abbiamo aggiunto l'anticorpo primario, ma non l'anticorpo secondario (Fig. 2E). Si può vedere un bel margine che rappresenta il autofluoresence lungo i confini endoteliale dei vasi. Ciò è coerente con il lavoro di Dan e collaboratori ^5. Tuttavia, né i piccoli punti di immunofluorescenza che rappresentano ER-α, né l'arbitro aspetto granularenando la presenza di numerosi recettori possono essere rilevati senza la combinazione di entrambi gli anticorpi primari e secondari. Abbiamo notato un modello distinto di autofluoresence lungo i margini endoteliale dei vasi. Questi test indipendente per la specificità degli anticorpi sono importanti in quanto confermano la specificità dell'anticorpo per ER-α e l'anticorpo secondario si lega al primario.

In conclusione, come dimostrato da altri ^{4, 5} vasi sanguigni del cervello contengono numerosi ER-α sottotipo di recettori. Nelle nostre mani, preparare 8μm fette trasversale da isolate arterie piale migliora colorazione e la visualizzazione dei recettori. I metodi tradizionali l'uso di microscopia confocale per esaminare i campioni. Avere la capacità di visualizzare seriale sezioni ottiche da campioni di spessore è un vantaggio importante della microscopia confocale. Tuttavia, l'acquisto di un buon microscopio confocale può essere molto costoso. Utilizzando estesa Profondità (FES) del software, abbiamo trovato chepotrebbero ridurre i nostri costi attrezzature. Utilizzando un microscopio a fluorescenza con EDF abbiamo ottenuto immagini chiare e sono in grado di visualizzare piale arteriosa ER-α su più livelli con Z-stack. Un vantaggio significativo del software EDF è che permette la cattura delle immagini in un modo efficace per creare un 3-D immagine dalle immagini. Per i laboratori che non hanno accesso a un microscopio confocale o i fondi per acquistare un microscopio digitale a fluorescenza con il software appropriato può essere una soluzione pratica e meno costoso a seconda degli obiettivi del ricercatore.