デジタル免疫蛍光顕微鏡を用いたラット軟膜細動脈におけるエストロゲン受容体-αのイメージング

以前、我々は一時的なグローバルな虚血性脳損傷後の血管拡張薬^7,8および血管収縮剤^9の両方に対応して直径を変更するには軟膜動脈の能力が著しく若い卵巣摘出ラットに押されていることを示した。慢性的なエストロゲンの補充は血管運動応答^7-9を復元します。さらに、遅延エストロゲン補充は、私たちは長期的なエストロゲンの枯渇がcerebrovasculatureのER -α濃度に影響を与えるかどうか疑問につながる軟膜動脈血管拡張容量¹⁰エストロゲンの有益な効果を逆転。我々は、西部は慢性的なエストロゲンの枯渇に応答して、ER -α発現の変化を評価するためにブロッティングと組み合わせた免疫蛍光ラベルを使用する予定です。我々は受容体の離散群の可視化にいくつかの困難があったので、我々はここで発揮する方法を変更。したがって、本研究で私たちの主な目標は、最初のビジュアルを最適化するために比較的簡単な方法を開発することでした軟膜細動脈における受容体の化。いくつかの報告と一致し^6,11,12で私たちがプロービングされた組織の種類、試料の厚さ、容器内のER -αの分布だけでなく、非特異的結合の程度を調整することが必要があると認める。

我々の手法は軟膜血管スライスのER -αの存在を可視化する非常に効果的です。しかし、他の人として以前に、興味、固定、ブロッキングプロトコルと組織の処理¹²のタンパク質の細胞内局在抗体の特異性と濃度に大きく依存するこれらのメソッドの使用が成功して指摘している。私たちの船の準備の可視化の前に我々はすべてのこれらの変数を動作するように時間を費やしました。我々はこの論文で我々のアプローチのいくつかを調整するために必要な方法強調している。

我々は最適軟膜細動脈にER -αを視覚化するために着手し、これにはいくつかの課題を提示。最初に、ラット軟膜動脈の平均サイズはややトリッキーな脳の表面から分離し、除去すること35から50ミクロンの間である。我々は前にエバンスブルー色素とその灌流犠牲にすることが動脈の解離が容易に発見。エバンスブルーは蛍光影響を与える可能性がありますが、我々はこの染料を使用する利点は、そのマイナーな欠点を上回ると感じている。我々のプロトコルでは船が数回洗浄されています。これは、血管内の残留色素を最小限に抑え、蛍光で染色した場合の影響を低減します。我々が遭遇した別の難しさは、軟膜血管セグメントの厚さは、困難な受容体の明確な可視化を行ったということでした。さらに、我々は、ER -αは、いくつかの細胞層全体に分散されたという事実におそらく原因で、特に明確な画像を得ることができなかった。我々は、長手方向の血管のスライス（他の人が持っているとして）で作業しようとしたが、マウント中のため小さい軟膜サイズには、血管を処理し、血管のねじれを防止することは困難であった顕微鏡を使用していても上をスライドします。最後に、我々が正常にクライオスタットを用いて、8μm厚のリングにクロス賢明な容器を切断することにより私たちのテクニックを変更しました。リングは、扱いやすいといくつかのスライドに取り付けることができます。

かつて我々はDanseshatalbと関連付けます^（11）で提案された船を固定して組織を凍結最初のフラッシュの効果をテストすることが必要だと感じたの船舶を取得しました。我々はわずかに少ない背景の免疫蛍光法を見つけたが、我々はまた、受容体が少ない激しく受容体の可視化をより困難に染色したと指摘した。その結果、我々は（一般的に1〜2カ月の間に）必要な時まで先制脳全体および店舗を凍結することを好む。我々は、その後、前述のように船をやってのけるし、クリオスタットでスライスする前に船を固定してください。我々はここに示すように。

一必要なステップは別々に一次と二次抗体の両方でコントロールを実行することです特異性とバックグラウンドの免疫蛍光法を決定する。エストロゲン受容体-α抗体は扱いが困難になる可能性があります。私達は私達の体の染色の成功に満足される前に実際には、我々は3つの異なる一次抗体を（1モノクローナルと2ポリクローナル）を試みた。弊社のコントロールの一環として、まず一次抗体の添加の省略によって一次抗体の特異性を検証する。図2Dは、一次抗体なしで容器を示しています。は染色とほんの少しのバックグラウンドシグナルはありません。一次抗体はポリクローナルであるため、一部のびまん性非特異的なバックグラウンド染色があります。第二に、我々は、一次抗体を加え、ではなく、二次抗体（図2E）。一つは、血管の内皮の境界線に沿ってautofluoresenceを表す素敵なマージンを見ることができます。これは、ダンと関連付けます⁵の仕事と一貫性があります。しかし、どちらのER -αを表す免疫の小さな点、また粒状の外観を参照数多くの受容体の存在ぶ必要がすることは、プライマリとセカンダリの両方の抗体の組み合わせに検出できます。我々は、血管の内皮縁に沿ってautofluoresenceの異なるパターンを指摘した。彼らはER -αに対する抗体の特異性を確認し、二次抗体が一次的に結合すると抗体の特異性のためのこれらの独立したテストは重要です。

結論では、他の⁴で示すように^、5脳の血管は、多数のER -αサブタイプ受容体が含まれています。私たちの手では、分離された軟膜動脈から8μm断面スライスを準備する染色と受容体の可視化を強化。伝統的な方法は、サンプルを検査する共焦点顕微鏡を使用。厚い標本から連続光学切片を表示する能力を持つことは、共焦点顕微鏡の重要な利点です。しかし、良好な共焦点顕微鏡の購入は非常に高価になることができます。拡張奥行き（EDF）ソフトウェアを使用することにより、我々は、ことがわかった当社の機器のコストを減らすことができる。 EDFと蛍光顕微鏡を用いて、我々は、クリアな画像を取得し、Z -スタックを使用して複数のレベルで軟膜動脈のER -αを視覚化することができます。 EDFのソフトウェアの大きな利点は、それが効果的に画像から3次元画像を作成する方法で、画像キャプチャを可能にするということです。 oneの充当ソフトウェアとデジタル蛍光顕微鏡を購入する共焦点顕微鏡へのアクセスや資金を持っていない研究室のために研究者の目標に応じて実践的かつ低コストのオプションがあります。