Preparación de ADN viral de nucleocápside

Los virus son parásitos obligados celular, y por lo tanto el estudio de su ADN requiere aislar material viral de distancia de los contaminantes de la célula huésped y el ADN. Varias aplicaciones posteriores requieren grandes cantidades de ADN viral pura, que es proporcionada por este protocolo. Estas aplicaciones incluyen la secuenciación del genoma viral, donde la extracción de ADN del huésped es crucial para optimizar la salida de datos de secuencias virales, y la producción de nuevas cepas virales recombinantes, ^1,2, donde la co-transfección de ADN purificado viral y plásmido lineal facilita la ^{recombinación., 3}

Este procedimiento utiliza una combinación de extracción y la densidad basado en la centrifugación para aislar ADN purificado herpesvirus nucleocápside lineal de las células infectadas. ^4,5 Los pasos de la purificación inicial objetivo de aislar a cápsidas virales purificados, que contienen y protegen el ADN viral en las extracciones y los pasos de centrifugación que eliminan las proteínas celulares y el ADN. Lisis de la nucleocápside libera el ADN viral, y dos finales de fenol-cloroformo pasos eliminar las proteínas restantes. El final de ADN capturado de la solución está muy concentrado y puro, con un promedio de _260/280 OD de 1,90. Dependiendo de la cantidad de células infectadas, los rendimientos de la gama de ADN viral 150 a 800 mg o más. La pureza de este ADN hace que sea estable durante el almacenamiento a largo plazo a 4 ° C. Este ADN es por lo tanto ideal para el alto rendimiento de secuenciación de alta fidelidad de las reacciones de PCR, y transfección.

Antes de comenzar el protocolo, es importante conocer el número promedio de células por plato (por ejemplo, un promedio de 8 x 10 ⁶ células PK-15 en un plato cm confluentes 15), y el título de la acción viral para ser utilizado ( por ejemplo, 1 x 10 ⁸ unidades formadoras de placas por ml). Estos son necesarios para calcular la multiplicidad apropiado de la infección (MOI) para el protocolo. ⁶ Por ejemplo, para infectar a un plato de 15 cm de células PK-15 con la acción viral por encima, en una MOI de 5, se utiliza 400 l de stock viral y la mezclan con 3,6 ml de medio (volumen de inoculación total de 4 ml para una placa de 15 cm).

Múltiples preparaciones de ADN viral se puede preparar al mismo tiempo. El número de preparaciones simultáneas está limitado sólo por el número de tubos en poder del rotor ultracentrífuga (uno por virus, consulte el paso 3.9 más adelante). A continuación se describe el procedimiento como si se hace por un virus.