ההכנה של ה-DNA ויראלי של Nucleocapsids
Summary
אנו מתארים את תהליך של בידוד הטוהר גבוהה ההרפס DNA nucleocapsid מן התאים הנגועים. ה-DNA הסופי שנתפסו מן הפתרון של ריכוז הטוהר גבוהה, מה שהופך אותו אידיאלי עבור סידור תפוקה גבוהה, איכות גבוהה התגובות PCR, ו transfections לייצר recombinants ויראלי חדש.
Abstract
וירוסים הם טפילים הסלולר מחייבות, ולכן המחקר של ה-DNA שלהם מחייב לבודד חומר ויראלי מן התא המארח מזהמים ו-DNA. יישומים במורד כמה דורשים כמויות גדולות של DNA ויראלי טהור, הניתן על ידי פרוטוקול זה. יישומים אלה כוללים רצף הגנום הויראלי, שם את הסרת DNA המארח הוא חיוני כדי לייעל את התפוקה נתונים עבור רצפים ויראלי, ואת הייצור של זנים חדשים רקומביננטי ויראלי, שבה שותף transfection מטוהרים של ה-DNA הנגיפי פלסמיד ו ליניארי מאפשר רקומבינציה. 1,2, 3
תהליך זה מנצל שילוב של עקירות וצפיפות מבוססי צנטריפוגה כדי לבודד מטוהרים DNA ההרפס ליניארי nucleocapsid מן התאים הנגועים. 4,5 השלבים טיהור ראשוני במטרה לבודד capsids ויראלי מטוהרים, המכילים ולהגן על ה-DNA הנגיפי במהלך עקירות צעדים צנטריפוגה כי להסיר חלבונים ו-DNA התאי. תמוגה של nucleocapsids אז משחרר ה-DNA הנגיפי, ושני האחרונים פנול, כלורופורם צעדים להסיר החלבונים הנותרים. ה-DNA הסופי שנתפסו מפתרון מרוכז מאוד טהור, עם OD 260/280 ממוצע של 1.90. בהתאם לכמות של תאים נגועים בשימוש, טווח התשואות של ה-DNA הנגיפי של 150-800 מיקרוגרם או יותר. טוהר DNA זה עושה את זה יציב במהלך האחסון לטווח ארוך ב 4C. זהו ה-DNA ובכך אידיאלי עבור סידור תפוקה גבוהה, איכות גבוהה התגובות PCR, ו transfections.
לפני תחילת הפרוטוקול, חשוב לדעת את המספר הממוצע של התאים לכל תבשיל (למשל ממוצע של 8 x 10 6 PK-15 תאים בצלחת ומחוברות 15 ס"מ), ואת titer של המניה ויראלי לשמש ( למשל, 1 x 10 8 פלאק יוצרי יחידות מ"ל). אלה נחוצים כדי לחשב את הריבוי המתאים של זיהום (משרד הפנים) עבור הפרוטוקול. 6 למשל, להדביק one 15 ס"מ צלחת של PK-15 תאים עם המניה ויראלי לעיל, משרד הפנים של 5, תשתמש 400 μl של מניות ויראלי לדלל את זה עם 3.6 מ"ל של מדיום (נפח חיסון הכולל של 4 מ"ל עבור one צלחת 15 ס"מ).
הכנות מרובות דנ"א ויראלי ניתן להכין בו זמנית. מספר הכנות סימולטני מוגבל רק על ידי מספר צינורות בידי הרוטור ultracentrifuge (אחד לכל וירוס, ראה שלב 3.9 להלן). כאן אנו מתארים את התהליך כאילו נעשה על וירוס אחד.
Protocol
Discussion
חלקים של פרוטוקול זה פותחו במקור עבור בידוד הדנ"א הוויראלי BSL4 התנאים, אבל זה מתאים באותה מידה שאינם BSL תנאים. 4 אנו בדרך כלל להשתמש בפרוטוקול זה על מנת לבודד דנ"א של אלפא herpesviruses PRV ו HSV-1, אשר יש הגנום דנ"א מוקף proteinaceous capsid ומוקף במעטפה השומנים. 7,8 אולם ס?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
החוקרים להעריך את תרומתם של גרג סמית', ליסה פומרנץ, מאט ליימן, Marlies אלדריג', הלינה Staniszewska Goraczniak ואנשי המעבדה Enquist בפרוטוקול זה כיוון עדין.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Freon (1,1,2-trichloro-1,2,2-trifluoroethane) | Fisher | T178-4 | Check with your institution for guidelines on appropriate disposal of Freon-containing waste, or see Mendez et al. for potential Freon alternatives.9 |
| Phase lock gel tubes, Heavy 15ml capacity | 5 PRIME | 2302850 | Optional |
| Polyallomer ultracentrifuge tubes | Beckman* | 331372* | *Select tubes appropriate for your own ultracentrifuge; these are included as an example only |
| NP-40 / IGEPAL | Sigma | I-3021 | |
| PK-15 cells | ATCC | CCL-33 | |
| Vero cells | ATCC | CCL-81 | |
| PBS | HyClone | SH30028.03 |
References
- Szpara, M. L., Parsons, L., Enquist, L. W. Sequence variability in clinical and laboratory isolates of herpes simplex virus 1 reveals new mutations. J Virol. 84, 5303-5313 (2010).
- Banfield, B. W., Kaufman, J. D., Randall, J. A., Pickard, G. E. Development of pseudorabies virus strains expressing red fluorescent proteins: new tools for multisynaptic labeling applications. J Virol. 77, 10106-10112 (2003).
- Kobiler, O., Lipman, Y., Therkelsen, K., Daubechies, I., Enquist, L. W. Herpesviruses carrying a Brainbow cassette reveal replication and expression of limited numbers of incoming genomes. Nat Commun. 1, 146-146 (2010).
- Enquist, L. W., Madden, M. J., Schiop-Stanley, P., Vande Woude, G. F. Cloning of herpes simplex type 1 DNA fragments in a bacteriophage lambda vector. Science. 203, 541-544 (1979).
- Smith, G. A., Enquist, L. W. Construction and transposon mutagenesis in Escherichia coli of a full-length infectious clone of pseudorabies virus, an alphaherpesvirus. J Virol. 73, 6405-6414 (1999).
- Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. . Principles of virology. , (2008).
- Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine. Microbiol Mol Biol Rev. 69, 462-500 (2005).
- Roizman, B., Pellett, P. E., Knipe, D. M., Howley, P. M. . Fields Virology. , 2381-2397 (2001).
- Mendez, I. I., Hermann, L. L., Hazelton, P. R., Coombs, K. M. A comparative analysis of freon substitutes in the purification of reovirus and calicivirus. J Virol Methods. 90, 59-67 (2000).
- Gharabaghi, F., Aymard, M., Trotemann, P., Gerdil, C. A rapid and simplified micromethod for subtyping varicella-zoster virus. J Med Virol. 31, 129-134 (1990).
- Granstedt, A. E., Szpara, M. L., Kuhn, B., Wang, S. S., Enquist, L. W. Fluorescence-based monitoring of in vivo neural activity using a circuit-tracing pseudorabies virus. PLoS One. 4, e6923-e6923 (2009).
