Preparação de DNA viral a partir nucleocapsids

Vírus são parasitas obrigatórios do interior celular e, assim, o estudo do seu DNA requer material isolante viral longe de contaminantes da célula hospedeira e DNA. Várias aplicações a jusante exigem grandes quantidades de DNA viral puro, que é fornecido por este protocolo. Estas aplicações incluem o seqüenciamento do genoma viral, onde a remoção do DNA do hospedeiro é fundamental para otimizar a saída de dados para seqüências virais, ea produção de novas linhagens recombinantes viral, onde co-transfecção de plasmídeos purificados e DNA viral linear facilita a recombinação. ^{1,2, 3}

Este procedimento utiliza uma combinação de extrações e densidade baseado centrifugação para isolar DNA purificado herpesvirus linear nucleocapsídeo das células infectadas. ^4,5 As etapas de purificação inicial visam isolar purificada capsídeos virais, que contêm e protegem o DNA viral durante a extração e as etapas de centrifugação que removem as proteínas celulares e DNA. Lise de nucleocapsids então libera DNA viral, e duas finais fenol-clorofórmio passos eliminar as proteínas restantes. O DNA final capturada a partir de solução é altamente concentrada e pura, com uma média de _260/280 OD de 1,90. Dependendo da quantidade de células infectadas utilizado, os rendimentos da faixa DNA viral 150-800 mg ou mais. A pureza deste DNA torna-se estável durante armazenamento a longo prazo em 4C. Este DNA é, portanto, ideal para high-throughput seqüenciamento de alta fidelidade reações PCR e transfections.

Antes de iniciar o protocolo, é importante saber o número médio de células por prato (por exemplo, uma média de 8 x 10 ⁶ células PK-15 em um prato centímetros confluentes 15), eo título do estoque viral a ser usado ( por exemplo, 1 x 10 ⁸ unidades formadoras de placas por ml). Estes são necessários para calcular a multiplicidade adequada de infecção (MOI) para o protocolo. ⁶ Por exemplo, para infectar um prato de 15 cm de PK-15 células com o estoque acima viral, em um MOI de 5, você usaria 400 mL de ações virais e diluir com 3,6 ml de meio (volume de inoculação total de 4 ml para uma placa de 15 cm).

Várias preparações de DNA viral podem ser preparados ao mesmo tempo. O número de preparações simultâneas é limitado apenas pelo número de tubos de posse do rotor ultracentrífuga (um por vírus; veja o passo 3.9). Aqui nós descrevemos o procedimento de como se está sendo feito por um vírus.