Nosso plano experimental é esquematicamente diagramado na Figura 1. 1. Crescimento e preparação de células-tronco neurais (NSCs) para transplante O EnStem-A linha celular (EMD Millipore) foi usado neste estudo. NSCs são rotineiramente validada pelo fabricante para altos níveis de expressão dos marcadores multipotentes nestina e Sox2, e de baixo nível de expressão do marcador pluripotentes Oct-4, juntamente com a capacidade de se diferenciar em vários fenótipos neuronal e manter um cariótipo normal após passagens múltiplas. De acordo com nossas condições de crescimento, estes NSCs exibida expressão abundante de Sox2 e nestina e mantiveram sua capacidade de se diferenciar, como descrito anteriormente 1. NSCs foram cultivadas em poli-L-ornitina (20 mcg / ml) e laminina (5 mg / ml) frascos de cultura de tecidos revestidos tratada. As células foram cultivadas em meio de expansão neural (Millipore) suplementado com L-glutamina (2 mM) e de fibroblastos básicofator de crescimento (bFGF; 20 ng / ml). Monocamadas adepto da NSCs foram várias passagens em dias alternados (1:2) com accutase como o agente de dissociação 1. Para estudos de transplante, NSCs foram usados em passagens abaixo de 10. NSCs foram marcadas com 5-bromo-2'-deoxiuridina (BrdU), completando o meio de crescimento, com 4 mm de BrdU por três dias antes do transplante. Para verificar o índice de BrdU rotulagem (ou seja, porcentagem de células BrdU positivas), as células foram semeadas em slides câmara e processados para detecção de BrdU usando abordagens de imunocitoquímica. Células utilizadas para transplante rotineiramente exibem rotulagem índices superiores a 90% 2. Alternativamente, transplantaram células-tronco humanas foram detectadas utilizando o marcador antígeno humano específico nuclear (HuNu) 2. No dia do transplante, accutase e media expansão neural foram pré-aquecido em banho-maria a 37 ° C. As células foram colocadas em meio de incubação (neural media de expansão contendo 10 mMde Y-27632) por uma hora. Y-27632 (ROCK inibidor, EMD-Calbiochem) foi usado para melhorar a sobrevivência de NSCs pós-transplante. Após uma hora, meio de incubação foi removido e as células foram tratadas com accutase por 5 minutos. Após este tratamento breve adicionar igual volume de meios de comunicação neural de expansão para neutralizar o accutase e tensão as células através de um filtro celular 70 mM. Contar as células com um hemocitómetro e preparar 1,0 x 10 5 NSCs viver por microlitro no meio de injeção (media de expansão neural contendo 10 mM de Y-27632, 40 ng / ml bFGF, 20 ng / ml BDNF). As células foram armazenados em mídia expansão neural (como descrito em 1.5) e mantidos em gelo até o momento do transplante, e deve ser usado dentro de 6h para minimizar a morte celular por prolongados de armazenamento a frio. 2. Radioterapia – o planejamento do tratamento e irradiação Rat atímicos sedado nude (s) foram colocados em um scanner de ressonância magnética no laboratório propensos positio n com o crânio no final superior (primeira cabeça). Este scanner 3 tesla é projetado para scans de pequenos animais. Ele pode fornecer contraste de tecidos moles requintada com alta resolução espacial transversal (axial) imagens. O scan centrado na região do crânio e um conjunto de 22 imagens T2 E60 ponderada com 0,8 milímetros de espessura imagem foram gerados. Estas imagens fornecem informações necessárias para identificar o hipocampo esquerdo e direito dentro do cérebro do rato. Após a ressonância magnética (24h), os animais foram sedados [cocktail anestesia (ketamina, 30 mg / kg, xilazina, 2,5 mg / kg e acepromazina, 1 mg / kg)] e colocado em uma radiação scanner CT em oncologia onde outro transversal (axial) volume imagem foi gerada. O rato foi colocado no mesmo ou próximo a mesma posição que usado para o exame de ressonância magnética e tomografia computadorizada a unidade foi criada para fazer a varredura da região do crânio. Um estudo de 106 imagens de CT com 0,8 milímetros de espessura imagem foi gerada, que tornou-se o CT de dados planejamento do tratamento. Planejamento de tratamentoha "> Os dados de imagem de ressonância magnética e tomografia computadorizada foram transferidos para o software de planejamento de ECLIPSE (Varian Medical Systems, Palo Alto, CA), o tratamento via DICOM (Digital Imaging and Communications, em Medicina). ECLIPSE é um software sofisticado e disponíveis comercialmente usados em oncologia de radiação para modelar e projetar o melhor plano de tratamento com radiação para o paciente. Ele incorpora informações de órgãos densidade que é extraído a partir dos dados de imagem CT e usado para calcular a distribuição de dose de radiação dentro do corpo. Cobrir o animal com uma cortina pequena cirúrgica com apenas a cabeça exposta. A posição do cabeça de animal firmemente dentro do quadro estereotáxico (Digital Benchmark, Leica-myNeurolab) inserindo barras de ouvido para o meato acústico externo. Tenha muito cuidado ao deslizar a ponta da barra de ouvido dentro do canal auditivo. Coloque a barra de incisivo ligando incisivos superiores do rato e ajustar a altura da barra até o ponto de referência padrão, em seguida, aperte clamp nariz. Centro a posiçãoda cabeça entre as barras de ouvido com o movimento lateral mínimo (± 4 mm) para alcançar zero estereotáxica. O próximo passo no processo é determinar a técnica de irradiação a ser utilizado. Terapia de arco de intensidade modulada radioterapia (IMRT) e volumetricamente modulada (VMAT) na forma de RapidArc são duas técnicas de alta precisão irradiação que utilizam um feixe de 6 MV de fótons para entregar uma dose de radiação 3-6. A diferença entre essas técnicas é que IMRT fornece uma dose usando várias trajetórias estáticas cada um correspondendo a uma direção diferente, mas convergindo no volume de destino mais adequado para volumes-alvo extremamente pequeno. RapidArc, por outro lado, fornece uma dose dinamicamente através de um ou mais arcos focada na região alvo (Fig. 4). Independentemente da técnica de entrega, informações sobre a dose-alvo, conforme alvo e restrições de dose em órgãos críticos têm que ser digitados na janela de otimização de dose em ECLIPSE. Tsua informação, juntamente com volumes órgão é utilizado para adequar a distribuição da dose, que é conseguido através continuamente variando a atenuação do feixe durante a irradiação. Uma vez que um plano foi gerado, ECLIPSE fornece a dose calculada sobreposta ao axial, imagens coronal e sagital (Fig. 5), bem como em dose-volume histograma formato (DVH) (Fig. 6). É neste ponto quando o plano deve ser avaliado para determinar se ele é adequado para a entrega ou precisa ser melhorado. Processo de irradiação Uma vez que um plano foi aprovado para a entrega, digitalmente reconstruída radiografia (DRR) imagens foram geradas a partir dos dados de tratamento CT planejamento em ECLIPSE. Estas são imagens ortogonais ponderados sobre a densidade óssea para destacar o crânio e outros marcos ósseos. Depois disso, o plano de tratamento e DRRs são enviados para o sistema de computador de tratamento de entrega via DICOM. O sistema de entrega controla um Varian Trilogy Linear Accelerator normally utilizado para radioterapia de seres humanos. O acelerador é equipado com 120 computador controlado colimadores multifolhas fina (MLC) e um diagnóstico da qualidade x-ray sistema de imagem incluído no on-board de imagem do sistema (OBI). Este sistema de entrega exporta as informações ECLIPSE-específicos e reconfigura os parâmetros colimador no acelerador para a entrega da dose planejada. Neste ponto, o rato foi preparado para irradiação, sedado e coberto com uma manta de papel para mantê-lo aquecido. Depois de alguns minutos, o rato, com o seu cobertor, mas com a cabeça exposta, foi colocado na mesa de tratamento na mesma posição usada para gerar a tomografia computadorizada. Esta é uma etapa crítica, pois a precisão posição está diretamente relacionada à precisão na entrega dose. Uma vez que o rato foi posicionado corretamente na mesa de tratamento, um conjunto de ortogonais radiografias é feita com o sistema Trilogy OBI. Estas são imagens de alta resolução que foram posteriormente fundida ao gerar ECLIPSEDRRs d usando o software OBI fusão de imagens. As imagens de raios-X e DRRs foram digitalmente combinados usando software que fornecem informações sobre as mudanças tabela posição que deve ser feito para conseguir co-registro das imagens (Fig. 7). Depois de analisar essas informações e verificar que as mudanças resultantes não inadvertidamente levar em qualquer colisões entre o acelerador ea mesa de tratamento, o computador se aplica as mudanças ea tabela de tratamento se move automaticamente para a posição desejada. Neste ponto, começa a irradiação. Para entregar uma dose de 10 Gy com um plano de IMRT 6-campo, o raio-on do tempo é de aproximadamente 10 minutos, enquanto um arco de dois RapidArc leva ~ 3 minutos. Após a entrega tratamento estiver completo, o rato foi retirado da sala de tratamento e permitiu recuperar em uma jaula segurando mantidos em uma almofada de aquecimento. 3. Cirurgia estereotáxica para intra-hipocampal transplante de células-tronco humanas Animals criação e preparação cirúrgica Para este estudo, foram empregados dois meses de idade ratos ATN adquiridos da National Cancer Institute (cepa 0N01 Cr: NIH-Rnu). Animais foram mantidos em gaiolas estéril e mantidos em uma temperatura e luz controladas barreiras Um ambiente com luz 12-h/12-h / ciclo escuro. Ratos foram fornecidos alimentos autoclavada e água ad libitum e cuidados foram tomados para prevenir a infecção dos olhos por olhos de limpeza todas as semanas com Vetropolycin pomada (Western Medical Supply, Arcadia, CA). Para a cirurgia estereotáxica, os ratos foram anestesiados com uma injeção ip de cocktail anestesia (ketamina, 30 mg / kg, xilazina, 2,5 mg / kg e acepromazina, 1 mg / kg). Completa anestesia foi induzida após 10-15 minutos e sedação foi monitorado usando reflexo palpável (pinch tep). Se necessário durante a cirurgia, 15-20% da dose original pode ser dada para manter a anestesia suficiente. Remover pêlos da cabeça usando cortadores elétricos. Aproximadamente200% da área de cirurgia deve ser raspada para prevenir a infecção pelos cabelos. Parte raspada limpa usando providone / iodo (3 vezes), seguido por álcool a 70% (3 vezes) antes da incisão. Cirurgia estereotáxica Estereotáxica instrumentos (digital monitorar e frame), broca micromotor, esterilizador leito seco e controladores devem ser mantidos em uma câmara de fluxo laminar para evitar uma possível infecção durante o procedimento de cirurgia em ratos ATN. Um palco estereotáxica com uma almofada de aquecimento incorporado pode ser usado para manter os animais quentes durante a cirurgia. Usamos "Kimberly-Clark Safeskin nitrilo Luvas de exame estéreis Púrpura 'thoughout a cirurgia. Estas luvas são embaladas individualmente em saco estéril (Cat. no. 55093). Além disso, o cirurgião usou spray de álcool 70% para esterilizar as mãos durante a cirurgia. Cobrir o animal com uma cortina pequena cirúrgica com apenas a cabeça exposta. A posição do cabeça de animal firmemente dentro do quadro estereotáxico (Digital Benchmark, Leica-myNeurolab) inserindo ouvido bars no conduto auditivo externo. Tenha muito cuidado ao deslizar a ponta da barra de ouvido dentro do canal auditivo. Coloque a barra de incisivo ligando incisivos superiores do rato e ajustar a altura da barra até o ponto de referência padrão, em seguida, aperte clamp nariz. O centro da posição da cabeça entre as barras de ouvido com o movimento lateral mínimo (± 4 mm) para alcançar zero estereotáxica. Após estas etapas de posicionamento, aplique pomada lubrificante para evitar a secagem e protegê-los de iodo possíveis derramamentos ou álcool. Use este perfume pelo menos 2 vezes durante a cirurgia. Fazer incisão na pele da linha média (2 cm) ao longo do couro cabeludo com bisturi estéril e limpa com algodão sterile o aplicador derrubado. Evitar danos durante o caudal e áreas músculos do pescoço. Usando afastador de dissecação, segure o periósteo e tecidos moles aberto clara usando o aplicador de algodão embebido em uma ponta de peróxido de hidrogênio% (made in PBS). Para parar a hemorragia, manter uma pressão firme por pelo menos 1 min usando o aplicador derrubado algodão ou gaze. Aplicar movimento firme de raspagem para limpar crânio e dabbing movimento para a pele até as suturas do crânio, bregma e lambda eram visíveis. Coordenadas precisas estereotáxica, referenciados ao bregma, foram determinadas usando o cérebro de rato atlas 7. O transplante de células-tronco foi feito em quatro locais distintos para cada hemisfério utilizando as seguintes coordenadas estereotáxica: Ântero-posterior (AP) 3.0 mm do bregma, medio-lateral (ML) 1,8 milímetros da linha média e dorso-ventral (DV) 3,2 milímetro da superfície do cérebro. AP, 3,6 mm; ML, 2,5 mm; DV, 3,2 mm AP, 4.2 mm; ML, 3,2 mm; DV, 3,2 milímetros AP, 4.2 mm; ML, 3,2 mm; DV, 3,2 milímetros Uma vez que o bregma foi identificado, todas as três coordenadas (AP, ML e DV) deve ser zerado no controlador de display digital / (na moldura digital estereotáxico). Em seguida, avance para marcar os locais precisos transplante (usando as coordenadas anteriores) Com uma caneta fina ponto de marcador ligado a uma pequena sonda titular na armação. Perfurar um buraco 0,35 mm (n º 04/01 burr dental, brocas de carboneto de vanádio) através do crânio usando o pedal da broca micromotor controlado (Leica-myNeurolab). Tome cuidado para evitar danos à membrana dura. Se o sangramento ocorre durante a perfuração, aplique uma pressão firme com aplicador de algodão derrubado. Não aplique álcool ou iodo no local da perfuração, pois isso irá causar irritação ao animal. Ratos receberam bilateral intra-hipocampal injeções de uma suspensão de NSCs injetado em um volume máximo de 1 mL usando a 5 mL Hamilton micro (30 gauge). O número exato de células dentro deste volume vai variar de acordo com especificidades experimental. Para conseguir isto, a micro estava ligado a um detentor pequena sonda no quadro estereotáxico. Insira cuidadosamente a ponta da agulha no crânio, até atingir a superfície do cérebro (meninges, por exemplo). Neste ponto, a coordenação DVte deve ser zerado no controlador de display digital /, em seguida, delicadamente inserir a agulha para a profundidade desejada (DV, 3,2 mm). Espere 1 min antes de iniciar qualquer injeção de células. Injetar 0,25 volume de mL / min (liberação lenta), utilizando um timer. Uma vez que um total de 1 mL é injetado, esperar 8 min antes de agulha retrátil a partir do site do transplante. Após este tempo, lentamente retrair a agulha do local de transplante (0,5 mm / min) para evitar o refluxo do conteúdo capilar de injeção de volta pela trilha da agulha. Siga os passos 3,2 (jk) para os sites transplante restante (4 por hemisfério). Remover o retrator pele do crânio e usar uma pinça blunt para puxar suavemente a pele para trás retraído e aplicar 4-5 estéril clips inoxidável usando Autoclips cirúrgica sutura aplicador (Leica-myNeurolab). Depois de retirar o animal do quadro, injetar com analgésicos (Buprenorphin, 0,1 mg / kg, sc, a cada 12h) e solução de Ringer Lactato (5 mL/250 g rato adulto, sc). Coloque a parte traseira de animais em sua gaiola, que deve ser mantida em uma almofada de aquecimento. Monitorar o animal até que ele se torna consciente antes de voltar para sua sala de exploração. Colocar um pouco umedecida pellets (animal ração) e transgel numa placa de Petri separadas em cada gaiola animal. Alternativamente, DietGel Recovery (CLEARH 2 O, Portland, ME) pode ser usado como uma fonte de água e nutrientes. Monitor de animais durante o seu tempo de recuperação e aplicar analgesia (buprenorfina 0,02 mg / kg (a cada 12h para 2 dias). Verifique se há sinais de dor, angústia, vermelhidão ou infecção do local da cirurgia. Aplicar providone / iodo ou pomada neosporin uma vez por dia (até 2 -3 dias) para evitar uma possível infecção. Se quaisquer sinais de infecção, dor ou desconforto persistir após o tratamento antibiótico ou analgésico dentro de 12 horas de cirurgia, consulte veterinário ou a equipe de cuidados de animais para obter mais assistência. 4. Resultados representativos: iles/ftp_upload/3107/3107fig1.jpg "/> Figura 1. Representação esquemática do nosso plano experimental. Figura 2. Fusão de CT (anatomia óssea) e RM (tecido mole) imagens dentro do software ECLIPSE. Correspondência de seções axial, coronal e sagital permitir a co-registro das características críticas anatômicas do cérebro de ratos derivados de cada modalidade de imagem. Figura 3. Arredondadas regiões do hipocampo do cérebro. Após a fusão de imagens, hipocampo e cérebro excluindo hipocampo são identificadas e contornadas axialmente definição de regiões específicas volumétrica para estes órgãos. Estas regiões fornecer informações anatômicas e volume necessário para o ajuste da distribuição de dose para o destino desejado (s). ure 4 "src =" files/ftp_upload/3107/3107fig4.jpg / "/> Figura 4. Opções de alta precisão utilizando irradiação de intensidade modulada radioterapia (IMRT) ou volumetricamente modulada terapia de arco (VMAT) na forma de RapidArc. Estas técnicas entregar 6 MV de fótons vigas ou como múltiplas trajetórias estáticos que podem convergir em volumes-alvo muito pequeno (IMRT), ou dinamicamente como um ou mais arcos focado na região de destino (RapidArc). Figura 5. ECLIPSE doses calculadas sobrepostas às imagens axiais. Doses são indicados para um ou dois hipocampos planos de tratamento de irradiação. Figura 6. ECLIPSE calculada histograma dose-volume. Dados contrastam a percentagem de irradiados em relação ao volume do hipocampo não irradiados sob o hippoc únicaAmpus plano de tratamento mostrado na figura. 5. Figura 7. Imagem posicionamento rato guiada para a radioterapia. Ortogonais digitalmente reconstruída radiografia (DRR) imagens geradas a partir dos dados de tratamento CT planejamento em ECLIPSE são fundidos para ortogonais imagens de raios X do rato em cima da mesa tratamento seguido com o Trilogy é on-board de imagem do sistema (OBI). O DRRs são ponderadas na densidade óssea que destaca o crânio e outros marcos ósseos que facilitam a co-registro com as imagens OBI. Correspondência destes conjuntos oferecem turnos tratamento tabela posição que deve ser feito para alcançar o co-registro do CT e x-ray imagens. Figura 8. Localização do NSCs transplantadas após a cirurgia estereotáxica. Em 1 mês pós-transplante, os animais foram perfundidos, os cérebros foram sectioned e coradas com BrdU (para detectar NSCs transplantados) e corados com hematoxilina balcão. A faixa de agulha (Nt, linha vermelha), indica a trajetória de injeção que NSCs depositados no local do transplante de liberação (Tr), logo abaixo do corpo caloso (CC) e acima do CA1. NSCs transplantados mostraram migração extensa de todo o hipocampo Tr host (giro denteado, DG; hilo denteado, DH; CA1 e CA3 subcampos; x4 ampliação). Escala de bar, 200 mM.
