Unsere experimentellen Plan ist schematisch in Abbildung 1 schematisch dargestellt. 1. Das Wachstum und die Vorbereitung des menschlichen neuralen Stammzellen (NSCs) für die Transplantation Die EnStem-A-Zelllinie (EMD Millipore) wurde in dieser Studie verwendet. NSCs werden routinemäßig vom Hersteller für ein hohes Maß an Ausdruck der multipotenten Marker Nestin und Sox2 und Low-Level-Ausdruck der pluripotenten Marker Oct-4, zusammen mit der Fähigkeit, sich in mehreren neuronalen Phänotypen differenzieren und zu einem normalen Karyotyp nach Aufrechterhaltung validiert mehrere Passagen. Im Rahmen unserer Wachstumsbedingungen, angezeigt diese NSCs reichliche Expression von Sox2 und Nestin und behielten ihre Fähigkeit, zu differenzieren, wie zuvor beschrieben 1. NSCs wurden auf Poly-L-Ornithin (20 ug / ml) und Laminin (5 pg / ml) beschichtet Gewebekulturen behandelte Kolben gezüchtet. Die Zellen wurden in neuronalen Expansion Medium (Millipore) mit L-Glutamin (2 mM) ergänzt und basischen Fibroblasten gezüchtetgrowth factor (bFGF, 20 ng / ml). Adhärente Monoschichten von NSCs wurden passagiert jeden zweiten Tag (1:2) mit Accutase als die Dissoziation Agent 1. Für die Transplantation Studien wurden NSCs in den Passagen unter 10 eingesetzt. NSCs wurden mit 5-Brom-2'-desoxyuridin (BrdU) durch die Ergänzung des Wachstums-Medien mit 4 uM BrdU drei Tage vor der Transplantation bezeichnet. Zur Überprüfung der BrdU Labeling Index (dh Anteil der BrdU-positiven Zellen) wurden die Zellen auf Chamber Slides vernickelt und verarbeitet BrdU-Erkennung unter Verwendung von Standard immunzytochemische Ansätze. Zellen für die Transplantation verwendet werden routinemäßig weisen Kennzeichnung Indizes über 90% 2. Alternativ wurden transplantiert menschlichen Stammzellen unter Verwendung des menschlichen spezifischen nuclear antigen marker (HuNu) 2. Am Tag der Transplantation wurden Accutase und neuronale Expansion Medien in einem 37 ° C Wasserbad vorgewärmt. Die Zellen wurden in Inkubationsmedium gestellt (neuronale Expansion Medien mit 10 pMvon Y-27632) für eine Stunde. Y-27632 (ROCK-Inhibitor, EMD-Calbiochem) verwendet wurde, um das Überleben der NSCs nach der Transplantation zu verbessern. Nach einer Stunde war Inkubationsmedien entfernt und die Zellen wurden mit Accutase behandelt für 5 Minuten. Nach dieser kurzen Behandlung das gleiche Volumen von neuronalen Expansion Medien, um die Accutase neutralisieren und Belastung der Zellen durch eine 70 uM Zellsieb. Zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer und bereiten 1,0 x 10 5 Live-NSCs pro Mikroliter in Injektionsmittel (neuronale Expansion Medien mit 10 uM der Y-27632, 40 ng / ml bFGF, 20 ng / ml BDNF). Die Zellen wurden in neuronalen Expansion Medien gespeichert (wie in 1.5 beschrieben) und auf Eis gehalten, bis zum Zeitpunkt der Transplantation, und sollte innerhalb von 6h verwendet werden, um den Zelltod bei längerer Kälte-Lagerung zu minimieren. 2. Strahlentherapie – Planung der Behandlung und Bestrahlung Sedated athymischer Ratte (n) wurden in einem Labor MRI-Scanner in der Bauchlage positio platziert n mit dem Schädel an der oberen Ende (Kopf zuerst). Das 3-Tesla-Scanner für kleine Tier-Scans ausgelegt. Es kann bieten exquisite Weichteilkontrast mit hoher räumlicher Auflösung Querschnitt (axial) Bilder. Die Prüfung auf dem Oberkopf und ein Satz von 22 T2 E60 gewichteten Bildern mit 0,8 mm Dicke Bild fokussiert generiert wurden. Diese Bilder liefern notwendige Informationen, um die linken und rechten Hippocampus in der Ratte Gehirn zu identifizieren. Nach der MRT-Untersuchung (24h), Tiere wurden betäubt [Anästhesie-Cocktail (Ketamin, 30 mg / kg, Xylazin, 2,5 mg / kg und Acepromazin, 1 mg / kg)] und in einem Radioonkologie CT-Scanner, wo eine andere Querschnitts- (axial) Bildvolumen generiert wurde. Die Ratte wurde in, die am selben oder nahe an der gleichen Stelle wie bei der Kernspintomographie genutzt und das CT-Gerät wurde auf dem Oberkopf zu scannen. Eine Studie von 106 CT-Bilder mit 0,8 mm Dicke wurde image erzeugt, wurden die CT-Behandlung Planungsdaten. Treatment Planningha "> Die MRI-und CT-Bilddaten wurden auf die ECLIPSE (Varian Medical Systems, Palo Alto, CA) Behandlungsplanung Software via DICOM (Digital-Imaging and Communications in Medicine) übertragen. ECLIPSE ist ein anspruchsvolles und kommerziell verfügbare Software in der Radioonkologie zur Modellierung und Design die besten Bestrahlungsplanung für einen Patienten. Es beinhaltet Orgel Dichte, die aus der CT-Bilddaten extrahiert und verwendet werden, um die Strahlendosis innerhalb des Körpers zu berechnen. Abdeckung des Tieres mit einem kleinen chirurgischen Tuch nur mit dem Kopf ausgesetzt. Position des Tieres Kopf fest in der stereotaktischen Rahmen (Benchmark Digital, Leica-myNeurolab), indem Sie Ohr Bars in den äußeren Gehörgang. Seien Sie äußerst vorsichtig beim Gleiten der Spitze des Ohres bar in den Gehörgang. Legen Sie die Schneidezahn bar durch Einhaken der Ratte oberen Schneidezähne und die Anpassung der Bar Höhe der Standard-Bezugspunkt, dann ziehen die Nase klemmen. Zentrieren Sie die Positionder Kopf zwischen den Ohren Bars mit minimalem seitlichen Bewegung (± 4 mm) zu stereotaktischen Null zu erreichen. Der nächste Schritt in diesem Prozess ist es, die Bestrahlung Technik verwendet werden soll bestimmen. Intensity Strahlentherapie (IMRT) und volumetrisch modulierte arc-Therapie (VMAT) in Form von RapidArc sind 2 hochpräzisen Bestrahlung Techniken, die ein 6 MV Photonen-Strahl zu verwenden, um eine Strahlendosis 3-6 liefern. Der Unterschied zwischen diesen Techniken ist, dass IMRT eine Dosis liefert mit mehreren statischen Trajektorien die jeweils eine andere Richtung, aber konvergierende an das Zielvolumen besser geeignet für extrem kleine Ziel-Volumes. RapidArc auf der anderen Seite liefert eine Dosis dynamisch durch einen oder mehrere Bögen auf der Zielregion (Abb. 4) konzentriert. Unabhängig davon, Lieferung Technik, Informationen über die Zieldosis, Ziel-Konformität und Dosisbeschränkungen zu kritischen Organen müssen in der Dosis-Optimierung Fenster in ECLIPSE eingegeben werden. Tseine Informationen zusammen mit Orgel Volumina ist es, maßgeschneiderte der Dosisverteilung, die durch die ständige Variation der Strahldämpfung während der Bestrahlung erreicht wird. Sobald ein Plan erstellt wurde, bietet ECLIPSE die berechnete Dosis überlagert, die axiale, koronale und sagittale Bilder (Abb. 5) sowie in Dosis-Volumen-Histogramm (DVH)-Format (Abb. 6). Es ist an dieser Stelle, wenn der Plan ausgewertet werden müssen, um zu bestimmen, ob es für die Lieferung oder muss verbessert werden soll. Bestrahlung Einmal wurde ein Plan für die Lieferung genehmigt, digital rekonstruiert Röntgenbild (DRR) Bilder aus dem CT Planung der Behandlung von Daten in ECLIPSE generiert wurden. Diese sind orthogonal Bilder auf die Knochendichte gewichtet, um den Schädel und andere knöcherne Orientierungspunkte zu markieren. Danach werden die Behandlung zu planen und DRRs auf die Behandlung Lieferung Computersystem via DICOM an. Das Fördersystem steuert eine Varian Trilogy Linear Accelerator normally zur Radiotherapie von Menschen genutzt. Der Beschleuniger wird mit 120 Computer gesteuert dünnen Multileafkollimatoren (MLC) und eine diagnostische Qualität x-ray Imaging System im On-Board-Imaging (OBI) System integriert ausgestattet. Diese Lieferung System lädt die ECLIPSE-spezifische Informationen und konfiguriert die Kollimator-Parameter in dem Beschleuniger für die Bereitstellung der geplanten Dosis. An diesem Punkt wurde die Ratte für die Bestrahlung vorbereitet, sediert und mit einem Papier Decke warm halten. Nach ein paar Minuten wurde die Ratte mit seiner Decke, aber mit dem Schädel ausgesetzt, auf dem Behandlungstisch in der gleichen Position verwendet werden, um die CT-Scan erzeugen platziert. Dies ist ein entscheidender Schritt, weil Positionsgenauigkeit liegt direkt um die Genauigkeit der Dosierung Lieferung korreliert. Sobald die Ratte wurde ordnungsgemäß auf dem Behandlungstisch positioniert, ist ein Satz von orthogonalen Röntgenaufnahmen gemacht mit dem Trilogy OBI-System. Dies sind Bilder mit hoher Auflösung, die anschließend auf die ECLIPSE generieren verschmolzend DRRs mit dem OBI Bildfusion Software. Die Röntgenbilder und DRRs wurden digital abgestimmten Software verwenden, die Informationen über die Position am Tisch verschiebt, dass gemacht zu Co-Registrierung der Bilder (Abb. 7) zu erreichen sein können. Nach der Überprüfung dieser Informationen und überprüfen, ob die daraus resultierenden Verschiebungen nicht versehentlich in eine Kollision zwischen dem Gaspedal und dem Behandlungstisch führen, gilt der Computer die Verschiebungen und die Behandlung Tisch bewegt sich automatisch an die gewünschte Position. An diesem Punkt beginnt Bestrahlung. Zur Bereitstellung einer 10 Gy Dosis mit einem 6-Feld IMRT-Plan wird der Strahl-on-Zeit ca. 10 Minuten, während eine Zwei-Bogen RapidArc dauert ca. 3 Minuten. Nach der Behandlung Lieferung abgeschlossen ist, wurde die Ratte aus dem Behandlungsraum entnommen und in eine Holding-Käfig auf einem Heizkissen gehalten erholen. 3. Stereotaktischen Operation intra-Hippocampus-Transplantation von menschlichen Stammzellen Animals Tierhaltung und OP-Vorbereitung Für diese Studie verwendeten wir 2 Monate alt ATN Ratten National Cancer Institute (Stamm 0N01 Cr: NIH-rnu) erworben. Die Tiere wurden in sterile Käfigen gehalten und gepflegt in einer Temperatur-und Licht gesteuert Barriere-A-Umgebung mit 12-h/12-h Hell / Dunkel-Zyklus. Die Ratten wurden autoklaviert Futter und Wasser ad libitum zur Verfügung gestellt und wurde darauf geachtet, Augenentzündung durch Reinigung Augen jede Woche mit Vetropolycin Augensalbe (Western Medical Supply, Arcadia, CA) zu verhindern. Für stereotaktischen Operation wurden die Ratten betäubt mit einer ip Injektion von Anästhesie-Cocktail (Ketamin, 30 mg / kg, Xylazin, 2,5 mg / kg und Acepromazin, 1 mg / kg). Vollständige Anästhesie induziert wurde nach 10-15 Minuten und Sedierung wurde unter Verwendung spürbar Reflex (toe Prise). Wenn während der Operation erforderlich ist, kann 15-20% der ursprünglichen Dosis verabreicht, um eine ausreichende Narkose aufrecht zu erhalten. Entfernen Fell vom Kopf mit elektrischen Haarschneidemaschinen. Ca.200% der OP-Bereich sollte rasiert, um eine Infektion durch Haare zu verhindern. Sauber rasierte Teil mit providone / Jod (3 mal) um 70% Alkohol (3 mal), bevor Einschnitt folgte. Stereotaktischen Operation Stereotaktischen Instrumenten (digital überwachen und Rahmen), Mikromotor bohren, trockenes Bett Sterilisator und Controller sollten in einer Laminar-Flow-Haube gehalten werden, um mögliche Infektion während der Operation Verfahren in ATN Ratten zu verhindern. Eine stereotaktische Bühne mit einem eingebetteten Heizkissen können Sie halten die Tiere warm während der Operation. Wir verwendeten "Kimberly-Clark Safeskin Purple Nitrile Sterile Untersuchungshandschuhe 'thoughout der Operation. Diese Handschuhe sind einzeln steril verpackt (Kat.-Nr. 55.093). Darüber hinaus verwendet Chirurg 70% Alkohol Spray Hände während der Operation zu sterilisieren. Abdeckung des Tieres mit einem kleinen chirurgischen Tuch nur mit dem Kopf ausgesetzt. Position des Tieres Kopf fest in der stereotaktischen Rahmen (Benchmark Digital, Leica-myNeurolab), indem Sie Ohr bars in den äußeren Gehörgang. Seien Sie äußerst vorsichtig beim Gleiten der Spitze des Ohres bar in den Gehörgang. Legen Sie die Schneidezahn bar durch Einhaken der Ratte oberen Schneidezähne und die Anpassung der Bar Höhe der Standard-Bezugspunkt, dann ziehen die Nase klemmen. Zentrieren Sie die Position des Kopfes zwischen den Ohren Bars mit minimalem seitlichen Bewegung (± 4 mm) zu stereotaktischen Null zu erreichen. Im Anschluss an diese Positionierung Schritte gelten Augensalbe zur Befeuchtung der Trocknung verhindert wird und Schutz vor möglichen Jod oder Alkohol verschüttet. Verwenden Sie diese Salbe mindestens 2 mal während der Operation. Machen Mittellinie Hautschnitt (2 cm) entlang der Kopfhaut mit sterilen Skalpell und sauber mit sterilen Wattestäbchen. Vermeiden Sie Schäden in caudal-und Nackenmuskulatur Bereichen. Durch die Verwendung von Sezieren Retraktor, halten Sie die Knochenhaut offen und klar Weichgewebe mit Wattestäbchen getaucht in 1%-igem Wasserstoffperoxid (made in PBS). Um Blutungen zu stoppen, halten festen Druck für mindestens 1 min mit Wattestäbchen oder Gaze. Festem Kratzen Bewegung Schädel und Tupfen Bewegung für die Haut reinigen, bis Schädelnähte wurden Bregma und Lambda sichtbar. Präzise stereotaktischen Koordinaten, bezogen auf das Bregma, wurden mit dem Rattenhirn atlas 7. Stammzell-Transplantation wurde auf vier verschiedene Standorte für jede Hemisphäre mit den folgenden stereotaktischen Koordinaten durchgeführt: Anterio-posterior (AP) 3,0 mm vom Bregma, medio-lateral (ML) 1,8 mm von der Mittellinie, und dorso-ventralen (DV) 3,2 mm von der Oberfläche des Gehirns. AP, 3,6 mm; ML, 2,5 mm; DV, 3,2 mm AP, 4,2 mm; ML, 3,2 mm; DV, 3,2 mm AP, 4,2 mm; ML, 3,2 mm; DV, 3,2 mm Sobald die Bregma identifiziert wurde, sollten alle drei Koordinaten (AP, ML-und DV) auf dem digitalen Display / Steuerung (auf der digitalen stereotaktischen Rahmen) auf Null gesetzt werden. Dann fahren Sie mit den genauen Standorten der Transplantation (mit den vorstehenden Koordinaten markieren) Mit einer feinen Spitze Filzstift an eine kleine Sonde Halterung am Rahmen. Bohren Sie ein Loch 0,35 (Nr. 1 / 4 Zahn-Grat, Hartmetall-Vanadium-Bohrer) durch den Schädel mit dem Fußpedal gesteuert Mikromotor Bohrer (Leica-myNeurolab). Achten Sie darauf, um Schäden an der Dura-Membran zu verhindern. Kommt es zu Blutungen während des Bohrens, festen Druck mit Wattestäbchen. Üben Sie keinen Alkohol oder Jod an der Bohrstelle, da diese Reizung des Tieres verursacht. Ratten erhielten bilateralen intra-Hippocampus-Injektionen einer Suspension von NSCs in einem Volumen von maximal 1 ul mit einem 5 ul Hamilton Mikroliterspritze (30 Gauge) injiziert. Die genaue Anzahl der Zellen innerhalb dieses Volumen wird nach experimentellen Einzelheiten variieren. Um dies zu erreichen, wurde der Mikroliterspritze eine kleine Sonde Halterung am stereotaktischen Rahmen befestigt. Schieben Sie die Spitze der Nadel in den Schädel bis zum Erreichen der Oberfläche des Gehirns (zB Hirnhaut). An diesem Punkt der DV Koordinationte auf der Digitalanzeige / Controller gelöscht werden sollen, dann vorsichtig die Nadel in die gewünschte Tiefe (DV, 3,2 mm). Warten Sie 1 Minute, bevor eine Injektion von Zellen. Inject 0,25 ul-Volumen / min (langsame Freisetzung) mit Hilfe eines Timers. Nach insgesamt 1 ul injiziert wird, warten 8 min vor Einfahren Nadel aus der Transplantationsmedizin vor Ort. Nach dieser Zeit langsam zurückzuziehen die Nadel aus der Transplantation vor Ort (0,5 mm / min) zur kapillaren Rückfluss der Injektion Inhalt zurück zu verhindern durch die Nadel zu verfolgen. Folgen Sie den Schritten 3,2 (jk) für die verbleibenden Transplantation Seiten (4 pro Hemisphäre). Entfernen Sie die Haut Retraktor aus dem Schädel und nutzen stumpfen Pinzette vorsichtig wieder eingefahren und der Haut anwenden 4-5 sterile Edelstahl-Clips mit Autoclips chirurgisches Nahtmaterial Applikator (Leica-myNeurolab). Nach dem Entfernen des Tieres aus dem Rahmen, mit schmerzstillenden Injektion (Buprenorphin, 0,1 mg / kg, sc, alle 12h) und Ringer-Laktat-Lösung (5 ml/250 g erwachsenen Ratte, sc). Legen Sie das Tier wieder in seinen Käfig, der auf einem Heizkissen gehalten werden sollten. Überwachen Sie die Tiere, bis sie bewusst vor der Rückkehr in ihre Beteiligung Raum wird. Legen Sie einige angefeuchteten Pellets (Tier chow) und transgel in einer separaten Petrischale in jedes Tier Käfig. Alternativ können DietGel Recovery (ClearH 2 O, Portland, ME) als eine Quelle von Wasser und Nährstoffen verwendet werden. Monitor Tiere während ihrer Genesung Zeit und gelten Analgesie (Buprenorphin 0,02 mg / kg (alle 12h für 2 Tage). Überprüfen Sie auf Anzeichen von Schmerzen, Qualen, Rötungen oder Infektion der Operation vor Ort. Apply providone / Jod oder Neosporin Salbe einmal täglich (bis 2 -3 Tage), um mögliche Infektionen zu verhindern. Wenn irgendwelche Anzeichen von Infektionen, Schmerzen oder Leiden folgenden Analgetikum oder Antibiotika-Behandlung innerhalb von 12 Stunden nach der Operation bestehen bleiben, wenden Tierarzt oder Tierpfleger für weitere Unterstützung. 4. Repräsentative Ergebnisse: iles/ftp_upload/3107/3107fig1.jpg "/> Abbildung 1. Schematische Darstellung unserer experimentellen Plan. Abbildung 2. Fusion von CT (knöcherne Anatomie) und MRT (Weichteil-) Bilder innerhalb der Eclipse-Software. Passende von axialen, koronalen und sagittalen Schnitte ermöglichen die Zusammenarbeit Registrierung der kritischen anatomischen Merkmale von Gehirn der Ratte aus jeder Bildgebungsmodalität abgeleitet. Abbildung 3. Konturierte Hippocampus Regionen des Gehirns. Im Anschluss an Bildfusion sind hippocampi und Gehirn ohne hippocampi identifiziert und konturierte axial Festlegung spezifischer volumetrischer Regionen für diese Organe. Diese Regionen bieten anatomischen und Volume-Informationen, die zur Anpassung der Dosisverteilung an das gewünschte Ziel (s). Abbildung 4 "src =" / files/ftp_upload/3107/3107fig4.jpg "/> Abbildung 4. Hochpräzise Bestrahlung Optionen mit Intensität Strahlentherapie (IMRT) oder volumetrisch modulierte arc-Therapie (VMAT) in Form von RapidArc. Diese Techniken liefern 6 MV Photonen entweder als mehrere statische Bahnen, die auf sehr kleinen Ziel-Volumes konvergieren kann (IMRT), oder dynamisch als eine oder mehrere Bögen auf der Zielregion (RapidArc) fokussiert. Abbildung 5. ECLIPSE berechneten Dosen übereinander zu den axialen Bildern. Dosen gelten für Single-oder Dual hippocampi Bestrahlung Pläne. Abbildung 6. ECLIPSE berechneten Dosis-Volumen-Histogramm. Daten Kontraste der Anteil der bestrahlten gegenüber den nicht bestrahlten Volumen des Hippocampus unter der einheitlichen hippocAmpus Behandlungsplan in Abb. gezeigt. 5. Abbildung 7. Bildgesteuerte Ratte Positionierung für die Radiotherapie. Orthogonal digital rekonstruierten Röntgenbild (DRR) Bilder aus dem CT Planung der Behandlung von Daten in ECLIPSE erzeugt werden, um orthogonale Röntgenaufnahmen der Ratte auf dem Behandlungstisch mit der Trilogie On-Board-Imaging (OBI) System übernommen verschmolzen. Die DRRs sind auf die Knochendichte, dass der Schädel und andere Knochen Sehenswürdigkeiten, die Co-Registrierung zu erleichtern mit dem OBI Bilder Highlights gewichtet. Passende dieser Sets bieten Behandlungstisch Position verschiebt, dass aus dem Co-Registrierung der CT-und Röntgenbilder zu erreichen sein muss. Abbildung 8. Lage der transplantierten NSCs folgenden stereotaktischen Operation. Bei 1-Monats nach der Transplantation, Tiere perfundiert wurden, wurden Gehirne sectioned und gefärbt mit BrdU (verpflanzt NSCs erkennen) und Zähler gefärbt mit Hämatoxylin. Der Stichkanal (Nt, rote Linie), zeigt die Injektion Flugbahn, die NSCs in das Transplantat-release site (Tr) hinterlegt, direkt unterhalb des Corpus callosum (CC) und oberhalb der CA1. Transplantierte NSCs zeigte eine ausgedehnte Wanderung von Tr während der Host Hippocampus (Gyrus dentatus, DG; dentatus Hilus, DH; CA1 und CA3 Teilfelder; Vergrößerung x4). Scale-bar, 200 um.
