頭蓋放射線療法によって引き起こされた認知機能障害の回復のための細胞移植戦略を幹

我々の実験計画を模式的に図1に図示しています。 1。移植用ヒト神経幹細胞（NSC）の成長と準備 EnStem -細胞株（EMDミリポア）は本研究で使用されていました。 NSCのは、日常的に複数のニューロン表現型に分化すると後の正常な核型を維持する能力と共に、多能性マーカーネスチンとSox2、及び多能性マーカーOCT – 4の低レベル発現、発現の高レベルについては、メーカーによって検証されています複数の通路。私たちの成長の条件の下で、これらのNSCは以前に1を説明するように、Sox2、及びネスチンの豊かな表現を表示して分化する能力を保持。 NSCのは、フラスコを扱うポリ- L -オルニチン（20μg/ mlの）およびラミニン（5μg/ ml）をコーティングした組織培養で増殖させた。細胞はL -グルタミン（2mM）を補充した神経増殖培地（ミリポア）および塩基性線維芽細胞で増殖させた成長因子（bFGF、20 ng / ml）を。 NSCの付着単分子膜は解離剤1としてaccutaseで（1:2）一日おきに継代した。移植の研究のために、NSCのは10以下に通路で使用されていました。 NSCのは、移植前の3日間4μMのBrdUによる増殖培地を補充することにより5 – ブロモ-2' – デオキシウリジン（BrdU）で標識した。 BrdUラベリングインデックス（のBrdU陽性細胞の例の割合）を確認するには、細胞をチャンバースライドに播種し、標準的な免疫細胞化学的ア ​​プローチを用いてBrdUの検出のために処理した。移植のために使用する細胞は日常的に90パーセント2の過剰にラベリングインデックスを示す。また、移植されたヒト幹細胞は、ヒト特異的核抗原マーカー（HuNu）2を用いて検出した。 移植の日に、accutaseと神経膨張媒体は、37℃の水浴にあらかじめ加温した。細胞は、培養培地（10μMを含む神経拡張メディアに入れ、のY – 27632）1時間。 Y – 27632（ROCK阻害剤、EMD -カルビオケム）がNSCの後の移植の生存率を改善するために使用された。 一時間後、インキュベーション培地を除去し、細胞を5分間accutaseで処理した。この短期間の治療後accutaseを中和し、70μmのセルストレーナーを介して細胞を引っ張らないように神経の拡張メディアの等量を追加。 haemocytometerで細胞をカウントし、注入媒体にマイクロリットル当たり1.0 × 10 5のライブのNSCを（神経膨張媒体は、Y – 27632、40 ng / mlのbFGFを、20 ng / mlのBDNFの10μMを含む）の準備。 細胞は、神経の拡張メディアに保存（1.5で説明したように）と移植時まで氷上で保存し、冷蔵長引くことによって細胞死を最小限に抑えるために6時間以内にご使用くださいれました。 2。放射線治療 – 治療計画と照射鎮静無胸腺ヌードラット（s）は発生しやすいpositioで研究室MRIスキャナーに入れ、優れた終わりに頭蓋骨を持つn個（頭初）。この3テスラのスキャナは、小動物のスキャンのために設計されています。それは、高い空間分解能断面（軸方向）の画像と絶妙な軟部組織のコントラストを提供することができます。頭蓋骨の地域および​​0.8 mmの画像の厚さは22 T2 E60強調画像のセットに焦点を当ててスキャンが生成されました。これらの画像は、ラットの脳内で左右の海馬を識別するために必要な情報を提供しています。 MRIスキャン（24）、動物を鎮静された[麻酔のカクテル（ケタミン、30 mg / kgの、キシラジン、2.5 mg / kgおよびアセプロマジン、1 mg / kgの）]に続いて、別の断面放射線腫瘍学のCTスキャナーに配置（軸方向）の画像の量が生成されました。ラットは、同じまたはMRIスキャンのために使用されるとCT装置は、頭蓋骨の領域をスキャンするように設定されたものと同じ位置に近くに置かれた。 0.8mmの画像の厚さ、106 CT画像の研究は、CTの治療計画のデータになったものが生成されました。 治療計画HA"> MRIとCTの画像データがDICOM（医療におけるデジタル画像と通信）を経由してECLIPSE（バリアンメディカルシステムズ、パロアルト、カリフォルニア州）治療計画ソフトウェアに移した。 ECLIPSEは、患者にとって最善の放射線治療計画モデルと設計への放射線腫瘍学で使用されている洗練された市販のソフトウェアです。それは、CT画像データから抽出し、本体内の線量分布を計算するために使用される臓器の密度の情報が組み込まれています。 公開されている唯一の頭と小さな手術用ドレープを使って動物をカバーしています。外耳道に耳の棒を挿入することにより、しっかりと定位フレーム（ベンチマークデジタル、ライカ- myNeurolab）内に動物の頭を置きます。外耳道に耳のバーの先端をスライドさせる際は、細心の注意を払ってください。ラットの上顎をフックし、標準的な基準点にバーの高さを調整することにより、切歯のバーを配置し、その後鼻のクランプを締めます。 センター位置定位ゼロを達成するための最小限の横方向の動き（± 4 mm）の耳の棒の間に頭の。 プロセスの次のステップは、使用する照射法を決定することです。 RapidArcの形で強度変調放射線治療（IMRT）と容積変調アーク治療（VMAT）は、放射線量3-6を実現する6 MV光子ビームを使用する2つの高精度な照射技術です。これらの技術の違いは、IMRTは別の方向にそれぞれ対応するいくつかの静的な軌道を用いて投与量を提供するが、非常に小さなターゲットボリュームのためのより適切なターゲットボリュームで収束です。一方、RapidArcは、ターゲット領域（ 図4）に焦点を当てつまたは複数の円弧を介して動的に用量を提供します。 関係なく、配信技術、目標用量に関する情報、ターゲットの適合と、重要な臓器への線量拘束値のは、Eclipseにおける線量最適化のウィンドウで入力する必要があります。 Tオルガンのボリュームと一緒に彼の情報が継続的に照射中にビームの減衰を変化させることによって達成される調整線量分布、するために使用されます。 計画が生成されると、Eclipseは軸方向、冠状および矢状画像（ 図5）するだけでなく、線量体積ヒストグラム（DVH）の形式（ 図6）に重畳計算された線量を提供します。それは計画が、それが配信または改善する必要が適しているかどうかを判断するために評価される必要がある場合は、この時点でです。 照射プロセスいったん計画は、デジタル再構成されたX線写真（DRR）画像はECLIPSEのCTの治療計画データから生成された、配信のために承認されました。これらは頭蓋骨と他の骨のランドマークを強調するために骨密度の加重直交するイメージです。その後、治療計画とDRRsは、DICOM経由して、治療の配信のコンピュータシステムに送信されます。 配信システムは、バリアントリロジー線形加速器nを制御するormally人間の放射線治療に使用されます。加速器は、120のコンピュータ制御の薄いマルチリーフコリメータ（MLC）と、オンボードのイメージング（OBI）システム内に含まれる診断品質X線イメージングシステムを装備しています。この配信システムにアップロードECLIPSE固有の情報と計画線量を提供するための加速器でコリメータのパラメータを再設定します。 この時点でラットは、照射の準備を鎮静し、それを暖かく保つために紙の毛布で覆われていた。数分後、その毛布はあるが露出した頭蓋骨を持つラットは、、CTスキャンを生成するために使用される同じ位置での治療テーブルの上に置かれました。位置精度は、直接線量配信の精度に相関しているため、これは重要なステップです。 ラットは、治療テーブルの上に正しく配置された後は、直交するX線画像のセットは、三部作のOBIシステムを使用して取得されます。これらは、その後ECLIPSE生成するために融合された高解像度の画像です。dは、OBIの画像融合ソフトウェアを使用してDRRs。 X線画像とDRRsは、デジタル画像の共同登録（ 図7）を達成するためになされる必要があるテーブルの位置の変化に関する情報を提供するソフトウェアを使用して一致していた。この情報を確認し、結果のシフトが誤ってアクセルと治療のテーブルの間の任意の衝突に導くことをしないことを確認した後、コンピュータは、シフトを適用し、治療の表は、目的の位置まで自動的に移動します。 この時点では、照射が開始されます。二弧RapidArcは〜3分かかる間、6フィールドIMRTの計画で10Gyの線量を提供するために、ビームオン時間は約10分です。治療の配信が完了すると、ラットは処置室から削除され、加熱パッド上に保持保持するケージで回復させた。 3。ヒト幹細胞の内海馬移植の定位手術 Animals畜産と外科的準備この研究では、我々は、国立がん研究所（：NIH – rnuひずみ0N01クロム）から取得した2ヶ月古いATNのラットを用いた。動物は、滅菌ケージ内に保持し、温度と光制御バリア12-h/12-h明/暗サイクルが掛かる環境下で維持した。ラットはVetropolycinの眼軟膏（西洋医学電源、アルカディア、カリフォルニア州）で毎週目を洗浄により、眼感染症を防ぐために取られたオートクレーブ処理した食物と水を自由に摂取してケアを提供されていました。 定位手術のために、ラットは麻酔のカクテルのip注射（ケタミン、30 mg / kgの、キシラジン、2.5 mg / kgおよびアセプロマジン、1 mg / kg）で麻酔した。完全な麻酔が10〜15分後に誘導され、鎮静が明白な反射を（つま先のピンチ）を用いてモニターした。手術中に必要に応じて、元の投与量の15-20％は、十分な麻酔を維持するために与えることができる。 電気バリカンを使って頭から毛皮を削除します。約手術の面積の200％は毛によって感染を防ぐために剃毛する必要があります。 providone /切開の前に70％アルコール（3回）に続いてヨウ素を（3回）を使用してクリーンな坊主部分。 定位手術定位の楽器（デジタルモニターとフレーム）、マイクロモータのドリル、ドライベッド滅菌器とコントローラがATNのラットの手術手順の間に感染の可能性を防ぐために、層流フードで維持する必要があります。埋め込まれた加熱パッド付き定位段階は手術中の動物たちを暖かく保つために使用することができます。我々は手術thoughout"キンバリークラークSafeskinパープルニトリル無菌試験の手袋"を使用。これらの手袋は、個別に（カタログ番号。55093）滅菌袋にパックされています。さらに、外科医は手術中に手を消毒するために70％アルコールスプレーを使用。 公開されている唯一の頭と小さな手術用ドレープを使って動物をカバーしています。耳BAを挿入することにより、しっかりと定位フレーム（ベンチマークデジタル、ライカ- myNeurolab）内に動物の頭を置いて外耳道にRS。外耳道に耳のバーの先端をスライドさせる際は、細心の注意を払ってください。ラットの上顎をフックし、標準的な基準点にバーの高さを調整することにより、切歯のバーを配置し、その後鼻のクランプを締めます。 センター定位ゼロを達成するために最小限の横方向の動き（± 4 mm）の耳の棒の間に頭の位置。 これらの位置決め手順に従って、乾燥を防止し、可能なヨウ素やアルコールの流出から保護するための潤滑眼軟膏を適用する。手術中にこの軟膏を少なくとも2倍を使用してください。 滅菌メスを使用して頭皮に沿って正中皮膚切開（2 cm）を作成し、滅菌綿棒を使ってきれいには、アプリケータをひっくり返した。尾と首の筋肉の領域での損傷を避ける。 解剖リトラクターを使用することにより、綿ひっくり返されたアプリケーターを使用して骨膜がオープンし、明確な軟部組織のまま、1％過酸化水素（PBS製）に浸漬した。出血を止めるために、少なくとも1マイルのためにしっかりと圧力を維持するn個の綿を使用すると、アプリケーターまたはガーゼをひっくり返した。頭蓋骨の縫合まで、肌のために頭蓋骨と軽くたたく動きをきれいにしっかりこするモーションを適用し、ブレグマとラムダが表示されていた。 ブレグマを基準とする正確な定位座標は、、ラット脳アトラス7を用いて測定した。幹細胞移植は、次の定位座標を用いて各半球の4つの別個のサイトで行われました。 脳の表面からブレグマからAnterio – 後方（AP）3.0 mmの正中線からメディオ横ずれ（ML）1.8ミリメートル、及び背腹（DV）3.2ミリメートル。 AP、3.6ミリメートル、ML、2.5ミリメートル、DV、3.2ミリメートル AP、4.2ミリメートル、ML、3.2ミリメートル、DV、3.2ミリメートル AP、4.2ミリメートル、ML、3.2ミリメートル、DV、3.2ミリメートルブレグマが識別されたら、3つすべての座標は（AP、MLおよびDV）デジタルディスプレイ/コントローラ（デジタル定位固定フレーム上）でゼロにする必要があります。その後、上記の座標を使用して正確な移植部位を（マークに進みます。）フレームに小さなプローブホルダに取り付けられた細かい点のマーカーペン付き。 フットペダル制御マイクロモータのドリル（ライカ- myNeurolab）を使用して、頭蓋骨を介して0.35ミリメートル穴（第4分の1歯科用バー、カーバイドバナジウムのドリルビットを）ドリル。硬膜への損傷を防ぐために注意してください。出血が掘削中に発生した場合は、綿ひっくり返されたアプリケーターを使用して、しっかりと圧力を適用する。これは動物に炎症を引き起こす場合があるので、ドリルのサイトでアルコールまたはヨウ素を適用しないでください。 ラットは5μLハミルトンマイクロシリンジ（30ゲージ）を用いて1μLの最大音量に注入NSCのサスペンションの両側内海馬注射を受けた。このボリューム内の細胞の正確な数は、実験的な仕様に応じて異なります。これを達成するために、マイクロシリンジは、定位固定フレーム上に小さなプローブホルダに装着された。脳（ すなわち髄膜）の表面に到達するまで、頭蓋骨に針の先端を慎重に挿入します。この時点で、DV coordinaTEは、静かに目的の深度（DV、3.2 mm）に針を挿入し、デジタルディスプレイ/コントローラにゼロする必要があります。任意のセルの注入を開始する前に、1分間待ってください。 タイマーを使用して0.25μLボリューム/分（徐放）注入。 1μLの合計が注入されると、移植部位から後退の針の前に8分を待つ。この時間の後、ゆっくりと針のトラックをバック射出内容のキャピラリー逆流を防ぐために、移植部位（0.5 mm /分）から針を引っ込める。 残りの移植部位（半球ごとに4）のためのステップ3.2（JK）に従う。 頭蓋骨から皮膚リトラクタを外し、静かに撤回皮膚を引っ張ると、オートクリップ外科用縫合糸アプライヤ（ライカ- myNeurolab）を使用して4〜5無菌ステンレスクリップを適用するには鈍ピンセットを使用してください。 フレームから動物を除去した後、鎮痛剤を注入（Buprenorphin、0.1 mg / kgの、皮下、あらゆる12H）と（5 mL/250 gの成体のラット、皮下）リンゲル液乳酸。 加熱パッドに保管してください戻って、そのケージで動物を置きます。それは、その判示の部屋に戻る前に意識的になるまで、動物を監視します。いくつかは、各動物のケージ内の別のペトリ皿にペレット（動物チョウ）とtransgelを湿ら置きます。また、DietGel回復（ClearH 2 O、ポートランド、ME）を水と栄養素の源として使用することができます。 彼らの回復時間の間に動物を監視し、鎮痛を（ブプレノルフィン0.02 mg / kgである（2日間ごとに12時間）が適用されます。手術部位の痛み、苦痛、発赤または感染の徴候がないか確認してください。（1日1回providone /ヨウ素またはネオスポリン軟膏を適用する2まで-3日）感染の可能性を防止する。感染の兆候が、痛みや苦痛は、手術の12時間以内に鎮痛剤や抗生物質治療後に続く場合は、さらなる支援のために獣医師や動物の医療スタッフにご相談ください。 4。代表的な結果： iles/ftp_upload/3107/3107fig1.jpg"/> 図1我々の実験計画の模式図。 図2 CT（骨の解剖学）とMRI（軟部組織）ECLIPSEのソフトウェア内の画像の融合。 、軸方向冠状、および矢状セクションのマッチングは、各画像診断法から派生したラットの脳の重要な解剖学的特徴の共同レジストリを可能にする。 図3は、脳の海馬領域の輪郭。画像融合、海馬と海馬を除く脳への後続を同定し、これらの臓器のために特定の体積領域を定義する軸方向に輪郭を描かれている。これらの領域は、目的のターゲット（複数可）への線量分布を調整するために必要な解剖学的およびボリューム情報を提供しています。 URE 4"SRC ="/ files/ftp_upload/3107/3107fig4.jpg"/> 図4。RapidArcの形で強度変調放射線治療（IMRT）または容積変調アーク治療（VMAT）を用いた高精度照射オプション。これらの技術は、6 MV光子は非常に小さなターゲットボリュームに収束可能な複数の静的な軌道のいずれかとしてビーム供給（IMRT）、または動的に対象地域（RapidArc）に焦点を当てつまたは複数の円弧として。 図5。軸方向の画像に重ね合わせたECLIPSE計算された線量。示すように、用量は、単一またはデュアル海馬の照射治療計画のためのものです。 図6。ECLIPSE計算された線量体積ヒストグラム。データは単一のhippoc下で、非照射海馬体積対照射の割合を対比してampusの治療計画は図に示す。 5。 図7。放射線治療のための画像誘導ラットのポジショニング。 EclipseでのCTの治療計画データから生成される直交デジタル再構成されたX線写真（DRR）の画像はトリロジーのオンボード画像（OBI）システムで撮影された治療のテーブルの上にラットの直交するX線画像に融合されています。 DRRsは、頭蓋骨とOBIの画像との共同登録を容易に他の骨のランドマークを強調し、骨密度で重み付けされます。これらのセットのマッチングは、CTやX線画像の共同登録を達成するためになされている必要があります治療のテーブルの位置のシフトを提供します。 図8。定位手術後の移植NSCの場所。移植後1ヶ月で、動物は灌流、脳はsectioneでしたdとのBrdU（移植のNSCを検出するため）とヘマトキシリン​​でカウンター染色した染色。針のトラック（NT、赤線）は、移植リリースサイト（TR）で、ちょうど脳梁（CC）を下回るとCA1上記のNSCを蒸着注入の軌跡を示しています。移植のNSCは、ホストの海馬（;歯門、DH、CA1とCA3サブフィールド、倍率× 4歯状回、DG）を通じてTRから大規模な移行を示した。スケールバー、200μmの。