Notre plan expérimental est schématisé schématisée à la figure 1. 1. La croissance et la préparation des cellules souches neurales humaines (NSC) pour la transplantation Le EnStem-Une lignée cellulaire (EMD Millipore) a été utilisé dans cette étude. NSC sont systématiquement validés par le fabricant pour des niveaux élevés d'expression de la nestine multipotentes marqueurs et Sox2, et à faible niveau d'expression du marqueur pluripotent Oct-4, ainsi que la capacité de se différencier en de multiples phénotypes neuronaux et de maintenir un caryotype normal après de multiples passages. Dans nos conditions de croissance, ces NSCs affiché expression abondante du Sox2 et nestine et ont conservé leur capacité à se différencier, comme décrit précédemment 1. NSC ont été cultivées sur la poly-L-ornithine (20 pg / ml) et la laminine (5 pg / ml) culture de tissus enduits flacons traités. Les cellules ont été cultivées dans un milieu d'expansion neural (Millipore) complétée par la L-glutamine (2 mM) et de fibroblaste de basefacteur de croissance (bFGF; 20 ng / ml). Monocouches adhérentes du CNS ont été repiquées chaque autre jour (1:2) avec accutase comme agent de dissociation 1. Pour les études de transplantation, NSC ont été utilisés à des passages en dessous de 10. NSC ont été marquées avec du 5-bromo-2'-désoxyuridine (BrdU) en complétant le milieu de croissance avec 4 uM de BrdU pendant trois jours avant la transplantation. Pour vérifier l'indice de marquage BrdU (à savoir le pourcentage de cellules BrdU positives), les cellules ont été étalées sur des lames de chambre et traitées pour la détection de BrdU en utilisant des approches standards immunocytochimiques. Les cellules utilisées pour la transplantation d'exposition couramment l'étiquetage des indices de plus de 90% 2. Alternativement, transplanté des cellules souches humaines ont été détectés en utilisant les humains marqueur spécifique antigène nucléaire (HuNu) 2. Le jour de la transplantation, et les médias d'expansion accutase neurales ont été pré-chauffé dans un bain d'eau à 37 ° C. Les cellules ont été placées en milieu d'incubation (médias d'expansion neurones contenant 10 pMde Y-27632) pendant une heure. Y-27632 (ROCK inhibiteur, EMD-Calbiochem) a été utilisé pour améliorer la survie des CNS post-transplantation. Après une heure, les médias d'incubation a été enlevé et les cellules ont été traitées avec accutase pendant 5 minutes. Après ce bref traitement ajouter un volume égal d'expansion des médias de neurones pour neutraliser les accutase et de la souche des cellules à travers une passoire 70 uM cellule. Compter les cellules avec un hémocytomètre et préparer 1,0 x 10 5 NSCs direct par microlitre au milieu d'injection (médias d'expansion neurones contenant 10 uM de Y-27632, 40 ng / ml de bFGF, 20 ng / ml de BDNF). Les cellules ont été stockées dans les médias d'expansion neural (comme décrit en 1.5) et conservé sur glace jusqu'au moment de la transplantation, et doit être utilisé dans 6h pour minimiser la mort cellulaire par prolongées d'entreposage frigorifique. 2. Radiothérapie – la planification du traitement et de l'irradiation Sedated rats athymiques nude (s) ont été placés dans un laboratoire de scanner IRM dans la positio sujettes n avec le crâne à l'extrémité supérieure (la tête la première). Ce scanner 3 Tesla est conçue pour les scans du petit animal. Il peut fournir des tissus mous exquise contraste avec haute résolution spatiale transversale (axiale) des images. Le scan concentré sur la région du crâne et un ensemble de 22 images E60 pondérée en T2 avec épaisseur 0,8 mm image ont été générés. Ces images fournissent les informations nécessaires pour identifier la gauche et la droite hippocampes dans le cerveau du rat. Suite à l'IRM (24h), les animaux ont été mis sous sédation [cocktail de l'anesthésie (kétamine, 30 mg / kg, la xylazine, 2,5 mg / kg et l'acépromazine, 1 mg / kg)] et placé dans un scanner CT radio-oncologie, où une autre transversale (axiale) du volume d'image a été générée. Le rat a été placé dans les mêmes ou à proximité de la position même que celui utilisé pour l'IRM et l'unité CT a été configuré pour analyser la région du crâne. Une étude des images CT 106 avec une épaisseur 0,8 mm image a été produite qui est devenu les données CT de planification du traitement. Planification du traitementha »> Les données d'image IRM et de tomodensitométrie ont été transférés vers le logiciel ECLIPSE (Varian Medical Systems, Palo Alto, CA) de planification de traitement via DICOM (Digital Imaging and Communications-en médecine). ECLIPSE est un logiciel sophistiqué et disponibles commercialement utilisé en radio-oncologie de modéliser et de concevoir le meilleur plan de rayonnement traitement pour un patient. Il intègre les informations de densité organe qui est extraite à partir des données d'image CT et utilisée pour calculer la distribution de dose de rayonnement au sein de l'organisme. Couverture de l'animal en utilisant un petit champ opératoire avec seulement la tête exposée. Positionnez la tête des animaux résolument dans le cadre stéréotaxique (Benchmark numérique, Leica myNeurolab) en insérant les barres d'oreille dans le conduit auditif externe. Prenez soin extrême lorsque vous faites glisser l'extrémité de la barre d'oreille dans le canal auditif. Placez la barre des incisives en accrochant incisives supérieures du rat et en ajustant la hauteur de la barre au point de référence standard, puis serrer le collier du nez. Centre de la positionde la tête entre les barreaux oreille avec un mouvement latéral minimal (± 4 mm) pour atteindre l'objectif zéro stéréotaxique. La prochaine étape dans le processus est de déterminer la technique d'irradiation pour être utilisé. La thérapie à l'arc à modulation d'intensité en radiothérapie (IMRT) et volumétrique modulée (VMAT) sous la forme d'RapidArc sont deux techniques d'irradiation de haute précision qui utilisent un faisceau de photons 6 MV pour délivrer une dose de rayonnement 3-6. La différence entre ces techniques est que l'IMRT délivre une dose à l'aide de plusieurs trajectoires statiques correspondant chacun à une direction différente, mais convergeant vers le volume cible plus adapté pour des volumes cibles extrêmement petites. RapidArc d'autre part, délivre une dose dynamique par un ou plusieurs arcs concentré sur la région cible (fig. 4). Indépendamment de la technique de la livraison, des informations sur la dose cible, la conformité cible et contraintes de dose aux organes critiques doivent être saisis dans la fenêtre d'optimisation des doses dans Eclipse. Tses informations avec des volumes d'organe est utilisé pour adapter la distribution de dose, qui est réalisé par constamment varier l'atténuation de faisceau pendant l'irradiation. Une fois qu'un plan a été généré, Eclipse fournit la dose calculée superposée à l'axial, des images coronales et sagittales (fig. 5) ainsi que dans l'histogramme dose-volume (DVH) format (Fig. 6). Il est à ce point où le plan doit être évalué pour déterminer s'il est approprié pour la livraison ou doit être améliorée. Processus d'irradiation Une fois qu'un plan a été approuvé pour la livraison, numériquement reconstruites Radiographie (RRC) images ont été générées à partir des données CT de la planification du traitement dans Eclipse. Ce sont des images orthogonales pondérées sur la densité osseuse pour mettre en évidence le crâne et d'autres repères osseux. Par la suite, un plan de traitement et de DRR sont envoyées au système informatique de traitement livraison via DICOM. Le système de livraison contrôle un Varian Trilogy Linear Accelerator normally utilisés pour la radiothérapie des humains. L'accélérateur est équipé de 120 ordinateurs contrôlés collimateurs multilames mince (MLC) et une qualité diagnostique des rayons X du système d'imagerie inclus dans le bord d'imagerie (OBI) du système. Ce système de livraison télécharge les informations ECLIPSE-spécifiques et reconfigure les paramètres dans le collimateur d'accélérateur pour délivrer la dose prévue. A ce stade, le rat a été préparé pour l'irradiation, sous sédation et recouvert d'une couverture papier pour le tenir au chaud. Après quelques minutes, le rat, avec sa couverture, mais avec le crâne apparentes, a été mis sur la table de traitement dans la même position utilisé pour générer le scanner. Ceci est une étape critique, car la précision de position est directement corrélée à la précision de la dose délivrée. Une fois que le rat a été placé correctement sur la table de traitement, un ensemble de orthogonale aux rayons X des images est prise en utilisant le système OBI de la trilogie. Ce sont des images à haute résolution qui ont été ensuite fusionnées à l'génèrent ECLIPSEDRR d utiliser le logiciel OBI fusion d'images. Les images aux rayons X et de DRR ont été numériquement en utilisant un logiciel adapté qui fournissent des informations sur les changements de position de table qui doit être fait pour atteindre la co-registration des images (fig. 7). Après avoir examiné ces informations et vérifier que les modifications qui en résultent ne sont pas par inadvertance dans toute collision entre l'accélérateur et la table de traitement, l'ordinateur applique les changements et la table de traitement se déplace automatiquement à la position désirée. À ce stade, l'irradiation commence. Pour délivrer une dose de 10 Gy avec un plan de 6-champ RCMI, le faisceau sur le temps est d'environ 10 minutes tout en un deux-arc RapidArc prend environ 3 minutes. Après l'administration du traitement est terminé, le rat a été retiré de la salle de traitement et a permis de récupérer dans une cage tenant conservés sur un coussin chauffant. 3. Chirurgie stéréotaxique intra-hippocampique transplantation de cellules souches humaines Unenimals élevage et de préparation chirurgicale Pour cette étude, nous avons utilisé deux rats mois ATN anciens acquis auprès du National Cancer Institute (souche 0N01 Cr: NIH-rnu). Les animaux ont été gardés dans des cages stériles et maintenu à une température et à la lumière obstacle un environnement contrôlé avec la lumière 12-h/12-h cycle jour / nuit. Les rats ont été fourni de la nourriture à l'autoclave et l'eau ad libitum et on a pris soin de prévenir l'infection oculaire par le nettoyage des yeux chaque semaine avec la pommade oculaire Vetropolycin (Western Medical Supply, Arcadia, Californie). Pour la chirurgie stéréotaxique, les rats ont été anesthésiés avec une injection ip de cocktail anesthésie (kétamine, 30 mg / kg, la xylazine, 2,5 mg / kg et l'acépromazine, 1 mg / kg). L'anesthésie a été induite complète après 10-15 minutes et la sédation a été contrôlée à l'aide réflexes palpables (pincement de l'orteil). Si nécessaire pendant la chirurgie, 15-20% de la dose initiale peut être donné pour maintenir l'anesthésie suffisante. Retirez la fourrure de la tête en utilisant une tondeuse électrique. Environ200% de la superficie chirurgie doit être rasé pour prévenir l'infection par les poils. Nettoyer une partie rasé à l'aide providone / iode (3 fois) suivi par l'alcool à 70% (3 fois) avant l'incision. Chirurgie stéréotaxique Stéréotaxique instruments (moniteur numérique et cadre), perceuse micromoteur, stérilisateur lit sec et les contrôleurs doivent être conservés dans une hotte à flux laminaire pour empêcher l'infection possible pendant procédure de chirurgie chez les rats ATN. Une étape stéréotaxique avec un coussin chauffant intégré peut être utilisé pour garder les animaux au chaud pendant la chirurgie. Nous avons utilisé «Kimberly-Clark Safeskin Violet gants en nitrile examen stérile» thoughout la chirurgie. Ces gants sont emballés individuellement dans un sachet stérile (Cat. no. 55093). En outre, le chirurgien utilise de pulvérisation 70% d'alcool pour stériliser les mains pendant la chirurgie. Couverture de l'animal en utilisant un petit champ opératoire avec seulement la tête exposée. Positionnez la tête des animaux résolument dans le cadre stéréotaxique (Benchmark numérique, Leica myNeurolab) en insérant l'oreille baRS dans le conduit auditif externe. Prenez soin extrême lorsque vous faites glisser l'extrémité de la barre d'oreille dans le canal auditif. Placez la barre des incisives en accrochant incisives supérieures du rat et en ajustant la hauteur de la barre au point de référence standard, puis serrer le collier du nez. Centre de la position de la tête entre les barreaux oreille avec un mouvement latéral minimal (± 4 mm) pour atteindre l'objectif zéro stéréotaxique. Après ces étapes de positionnement, appliquer la pommade oculaire lubrifiant pour éviter le dessèchement et les protéger de l'iode ou des déversements possibles d'alcool. Utilisez cette pommade au moins 2 fois pendant la chirurgie. Faire une incision cutanée médiane (2 cm) le long du cuir chevelu à l'aide scalpel stérile, et nettoyer à l'aide de coton stérile applicateur incliné. Éviter les dommages au caudale et les muscles du cou domaines. En utilisant écarteur dissection, maintenez le périoste ouverte et claire des tissus mous en utilisant l'applicateur coton-tige trempé dans une eau oxygénée% (faite dans le PBS). Pour arrêter le saignement, de maintenir une pression ferme pendant au moins 1 kmn utilisant du coton-tige ou de la gaze. Appliquer mouvement ferme gratter pour nettoyer le crâne et le mouvement pour la peau en tamponnant jusqu'à ce sutures du crâne, bregma et lambda étaient visibles. Précis coordonnées stéréotaxiques, référencé au bregma, ont été déterminés en utilisant le cerveau du rat atlas 7. Transplantation de cellules souches a été réalisée sur quatre sites distincts pour chaque hémisphère en utilisant les coordonnées suivantes stéréotaxique: Antéro-postérieur (AP) 3,0 mm du bregma, médio-latérale (ML) à partir 1.8mm ligne médiane, et dorso-ventral (DV) 3.2mm de la surface du cerveau. AP, 3,6 mm; ML, 2,5 mm; DV, 3,2 mm AP, 4,2 mm; ML, 3,2 mm; DV, 3,2 mm AP, 4,2 mm; ML, 3,2 mm; DV, 3,2 mm Une fois que le bregma a été identifié, tous les trois coordonnées (AP, ML et DV) devrait être mis à zéro sur le contrôleur d'affichage numérique / (sur le cadre numérique stéréotaxique). Ensuite, passez à marquer les sites de transplantation précis (en utilisant les coordonnées ci-dessus) Avec un marqueur à pointe fine attachée à un titulaire de petite sonde sur le cadre. Percez un trou de 0,35 mm (n ° 1 / 4 fraise dentaire, les bits foret carbure de vanadium) à travers le crâne à l'aide de la pédale micromoteur forage contrôlée (Leica-myNeurolab). Prenez soin d'éviter d'endommager la membrane-mère. Si le saignement survient pendant le forage, appliquez une pression ferme en utilisant l'applicateur coton-tige. Ne pas appliquer d'alcool ou de l'iode sur le site de forage, comme cela va provoquer une irritation de l'animal. Les rats ont reçu bilatéraux intra-hippocampique injections d'une suspension de NSCs injectée dans un volume maximal de 1 uL utilisant une microseringue Hamilton 5 uL (calibre 30). Le nombre précis de cellules au sein de ce volume varie en fonction de spécificités expérimentales. Pour ce faire, la microseringue a été fixé à un support petite sonde sur le cadre stéréotaxique. Insérez délicatement le bout de l'aiguille dans le crâne jusqu'à la surface du cerveau (les méninges par exemple). À ce stade, la coordi DVTe doit être mis à zéro sur le contrôleur d'affichage numérique /, puis insérez doucement l'aiguille à la profondeur désirée (DV, 3,2 mm). Attendre 1 min avant d'initier toute injection de cellules. Injecter 0,25 volume ul / min (à libération lente) à l'aide d'une minuterie. Une fois un total de 1 ul est injectée, attendre 8 min avant l'aiguille rétractable à partir du site de transplantation. Après ce temps, lentement, se rétractent l'aiguille sur le site de transplantation (0,5 mm / min) pour empêcher le reflux du contenu capillaire d'injection en arrière à travers la piste de l'aiguille. Suivez les étapes 3.2 (jk) pour les sites de transplantation reste (4 par hémisphère). Retirer l'écarteur peau du crâne et utiliser des pinces émoussées pour tirer doucement la peau en arrière rétracté et appliquer 4-5 stériles clips inox à l'aide de suture chirurgicale autoclips applicateur (Leica-myNeurolab). Après avoir enlevé l'animal à partir du cadre, injecter analgésiques (buprénorphine, 0,1 mg / kg, sc, toutes les 12h) et de lactate de Ringer (5 ml/250 g rat adulte, sc). Placez le dos de l'animal dans sa cage qui doit être conservé sur un coussin chauffant. Surveiller l'animal jusqu'à ce qu'il devient conscient avant de retourner à sa salle d'attente. Placez quelques humidifié boulettes (animale Chow) et transgel dans un plat séparé de Pétri dans chaque cage pour animaux. Alternativement, DietGel Recovery (ClearH 2 O, Portland, ME) peut être utilisé comme une source d'eau et de nutriments. Surveiller les animaux pendant leur temps de récupération et d'appliquer l'analgésie (buprénorphine 0,02 mg / kg (toutes les 12h pendant 2 jours). Vérifiez les signes de douleur, de détresse, des rougeurs ou une infection du site opératoire. Appliquer providone / iode ou un onguent neosporin fois par jour (jusqu'à 2 jour -3) pour prévenir l'infection possible. Si des signes d'infection, la douleur ou de détresse persistent après un traitement antalgique ou antibiotique dans les 12 heures de chirurgie, de consulter un vétérinaire ou le personnel de soins aux animaux pour plus d'assistance. 4. Les résultats représentatifs: iles/ftp_upload/3107/3107fig1.jpg "/> Figure 1. Représentation schématique de notre plan expérimental. Figure 2. Fusion de CT (anatomie osseuse) et IRM (tissus mous) des images dans le logiciel Eclipse. Jumelage des coupes axiales, coronales et sagittales permettent la co-registre des caractéristiques essentielles anatomique du cerveau de rat provenant de chaque modalité d'imagerie. Figure 3. Contoured régions hippocampiques du cerveau. Suite à la fusion d'images, hippocampes et le cerveau hors hippocampes sont identifiés et profilée axialement définissant spécifiques des régions volumétrique pour ces organes. Ces régions fournissent des informations anatomiques et le volume nécessaires pour adapter la distribution de dose à la cible souhaitée (s). Ure 4 "src =" / files/ftp_upload/3107/3107fig4.jpg "/> Figure 4. Haute options d'irradiation de précision à l'aide à modulation d'intensité en radiothérapie (IMRT) ou la thérapie à l'arc volumétrique modulée (VMAT) sous la forme d'RapidArc. Ces techniques livrer 6 photons MV poutres soit en tant que de multiples trajectoires statiques qui peuvent converger sur des volumes très petite cible (IMRT), ou dynamique comme un ou plusieurs arcs concentré sur la région cible (RapidArc). Figure 5. Doses calculées ECLIPSE superposées aux images axiales. Les doses indiquées sont pour les plans hippocampes simple ou double traitement par irradiation. Figure 6. ECLIPSE calculée histogramme dose-volume. Données contrastes du pourcentage de la irradié en fonction du volume hippocampique non irradiés sous la seule hippocplan de traitement Ampus Fig. 5. Figure 7. Positionnement rat guidée par l'image pour la radiothérapie. Orthogonal numériquement reconstruites Radiographie (RRC) images générées à partir des données CT de la planification du traitement dans Eclipse sont fusionnées à orthogonaux images aux rayons X du rat sur la table de traitement prises avec à bord de la trilogie d'imagerie (OBI) du système. La DRR sont pondérées sur la densité osseuse qui met en évidence le crâne et d'autres repères osseux qui facilitent la co-registration avec les images OBI. Matching de ces ensembles de fournir un traitement déplace de table position qui doit être fait pour atteindre les co-inscription de la CT et des images de radiographie. Figure 8. Localisation de NSCs transplantés après la chirurgie stéréotaxique. À 1 mois post-transplantation, les animaux ont été perfusés, les cerveaux ont été sectioned et colorées avec BrdU (pour détecter NSCs transplantés) et contre-colorées à l'hématoxyline. Le trajet de l'aiguille (Nt, ligne rouge), indique la trajectoire d'injection qui ont déposé des CNS sur le site de transplantation de libération (Tr), juste en dessous du corps calleux (CC) et au-dessus du CA1. NSCs transplantés a montré une importante migration de TR à travers l'hippocampe hôte (gyrus denté, la DG; hile denté, DH; CA1 et CA3 sous-champs; x4 grossissement). La barre d'échelle, 200 um.
