Proteomik Analizleri Fare Vitreus ve Retina eviserasyon

1. Ön segment diseksiyonu. Limbus posterior skleral doku 0.22 forsepsle ve dünya (göz topu) stabilize ile kavradı. Mikrocerrahi bıçak limbustan limbus kornea doğrusal bir kesi yapmak için kullanılır. A 0.12 Colibri forsepsle sonra kornea kesi kavramak için kullanılır. Ön kamara sıvısı sonra Weck-Cel cerrahi mızrak ile emilir. 2. Lens eviserasyon. Kornea açgözlü bir 0.12 Colibri forsepsle dünya stabilize etmek için kullanılır. Dünyanın arka yönüyle doğru objektif arkasında ince kavisli bir iğne tutucu (ya da eğri soyunma forseps) eklenir. Iğne tutucu kısmen kapalı ve öne çekti. Basınç göz duvarında olduğu gibi bırakarak korneal kesiden lens ileri iter sklera, dış yüzeyinde forseps kullanılarak uygulanır. Vitreus saydam bir jel gibi görünür ve objektif kısmen yapışık. Lens vitreus dokusu daha sonra PBS içinde çözünmüş proteaz inhibitörü kokteyl (Roche) 20 mikrolitre içeren filtrelenmiş bir santrifüj tüpü içine yerleştirilir. 3. Retina eviserasyon. Korneal kesi açgözlü 0.12 Colibri forseps ile dünya stabilize etmek için devam edin. Ince kavisli bir iğne tutucu (ya da eğri soyunma forseps), optik sinir yakınında, mümkün olduğu kadar dünya arka yerleştirilir. Iğne tutucu kısmen kapalı ve öne çekti. Basınç, sklera, retina korneal kesiden ileri iter dış yüzeyinde forseps kullanılarak uygulanır. Vitreus retina yapışık yarı saydam bir jel gibi görünür. Retinada sarı, damarlı bir doku olarak görünür. Herhangi bir pigmentli doku şeritler forseps ile soyulmuş olabilir. Retina-vitreus dokusu daha sonra lens vitreus dokusu içeren filtrelenmiş bir santrifüj tüpüne yerleştirilir. 4. Santrifüj Filtreli. Benchtop santrifüj süzülmüş santrifüj tüp yerleştirilir. 12 dakika 14.000 x G Spin. Vitreus alt odası, eluant aspire. Retinanın üst odasında kalır. Bu örnekler, protein çalışmaları için kullanılabilir. 5. Temsilcisi Sonuçlar Vitreus örnekleri, SDS-PAGE (Şekil 2) ile analiz edildi. Örnekleri de bir enzimatik aktivite assay (Şekil 3) için kullanılır. Şekil 1. Fare göz diyagramı. Insan ve fare göz kesit şematik büyük lens nedeniyle fare göz göreceli küçük vitreus hacmi gösterir. Şekil 2. Bir boyutlu SDS-PAGE fare vitreus ve retina. Protein fare vitreus profilleri, 13.6 mg / ml (şerit 1), ve retina, 11.35 mg / ml (2 şeritli). Jel elektroforezi Flamingo floresan jel boyası ile boyanmış, 45 dakika için 150 kV ve VersaDoc Görüntüleme sistemi (BioRad, Hercules, CA) kullanılarak görüntülendi. Şekil 3. Fare ve insan vitreus Süperoksit dismutaz (SOD) enzim aktivitesi. Toplam SOD aktivitesi ölçümü (SOD aktivitesi kolorimetrik aasay kiti, # AB65354 Abcam, Inc, Cambridge, MA), DBA ve albino fareler eviserasyon tarafından toplanan vitreus ve retina üzerinde yapıldı. Bu insan vitreus çekirdek ve göreceli etkinliğini belirlemek için post-mortem insan donör gözleri toplanan insan retina SOD aktivitesi ile karşılaştırıldı. Sulandırılmamış vitreus karot numuneleri elle, 23 gauge iğne, 11 ve retina göz çiçekli ve RPE / koroid kompleksi uzak doku kesim tarafından toplanan ile aspire edildi . Tahlil SOD izoformları arasında ayrım yapmaz rağmen sadece ekstraselüler izoformu olduğundan, vitreus SOD aktivitesi, SOD3 yansıtmak için büyük olasılıkla 12 retinanın SOD aktivitesi üç SOD izoformları yansıtması muhtemeldir. Intrasellüler SOD1, mitokondriyal SOD2 ve ekstrasellüler SOD3. (12), bu SOD tahlil da dahil olmak üzere son derece hassas enzimatik Testler için, proteinlerin çapraz bulaşma olasılığı mümkündür ve daha fazla çalışma gerektirir. Hata çubukları SEM temsil eder.