プロテオーム解析のためのマウスの硝子体と網膜の内臓摘出

1。前眼部の解剖。 角膜輪部に後部強膜組織を0.22 forcepと地球儀（眼球）安定していると把握されています。 顕微ブレードは、角膜輪部から角膜輪部に角膜の線形切開を行うために使用されます。 0.12コリブリforcepは、切開で角膜を把握するために使用されます。 前房の流体は、その後ベックリキセル外科槍で吸収される。 2。レンズ内臓摘出。 角膜を把握0.12コリブリforcepは世界を安定させるために使用されます。 細かいカーブニードルホルダーは（または曲線麦粒鉗子）世界の後面に向かってレンズの後ろに挿入されます。ニードルホルダーは部分的に閉じられ、そして前方に引っ張られている。圧力は、眼の壁をそのままにして角膜を切開して前方にレンズを押し出す強膜の外表面にピンセットを用いて適用されます。硝子体は半透明のゲルとして表示され、レンズに部分的に付着しています。 レンズ、硝子体組織をPBSに溶解したプロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche）の20マイクロリットルを含むフィルタリング遠心分離管に配置されます。 3。網膜の内臓摘出。 角膜切開を把握0.12コリブリ鉗子で地球を安定させるために引き続き。 細かいカーブニードルホルダーは（または曲線麦粒鉗子）視神経の近くに、できるだけ地球にはるかに後方に配置されます。ニードルホルダーは部分的に閉じられ、そして前方に引っ張られている。圧力は、角膜を切開して前方に網膜を押す強膜の外表面にピンセットを用いて適用されます。硝子体が網膜に付着している半透明のゲルとして表示されます。網膜は黄色、血管組織として可視化される。色素組織の任意のストリップは、鉗子で剥離することができます。 網膜硝子体の組織を、レンズ、硝子体の組織を含むフィルタ処理された遠心分離管に配置されます。 4。フィルタリングされた遠心分離。 フィルタリングされた遠心管は、ベンチトップ遠心機に配置されます。 12分間14,000 × Gで回転する。 硝子である下部チャンバ、から溶離液を吸引除去する。網膜は、上室に残ります。これらのサンプルは、タンパク質の研究に利用することができます。 5。代表的な結果硝子体サンプルはSDS – PAGE（図2）により分析した。サンプルはまた、酵素活性アッセイ（図3）を使用しました。 図1マウスのアイダイアグラム。ヒトとマウスの眼の断面模式は、その大きなレンズのためにマウスの眼の相対的な小さな硝子体の体積を示しています。 図2一次元SDS – PAGEマウスの硝子体と網膜の。マウスの硝子体、13.6 mg / mLの（レーン1）、および網膜のタンパク質プロファイル、11.35 mg / mLの（レーン2）。ゲル電気泳動は、フラミンゴ蛍光ゲル染色で染色、45分、150 kVで行い、VersaDocイメージングシステム（バイオラッド、ヘラクレス、CA）を用いて可視化した。 図3。マウスとヒト硝子体中のスーパーオキシドジスムターゼ（SOD）酵素活性 。総SOD活性の測定（SOD活性を比色aasayキット、＃AB65354、アブカム株式会社、ケンブリッジ、MA）は、DBAとアルビノマウスの内臓摘出によって収集された硝子体と網膜を行った。これは、人間の硝子体コアと相対活性を決定するために事後ヒトドナーの目から採取したヒトの網膜におけるSODの活性と比較した。希釈していないガラス質コア試料は、手動で11、23ゲージの針を用いて吸引され、網膜は目の開花とRPE /脈絡膜複合体から離れて組織を切断して回収した。アッセイは、SODのアイソフォームを区別しませんが、それが唯一の細胞外アイソフォームであるため、ガラス質のSOD活性は、SOD3を反映する可能性が高い12網膜のSOD活性は、3つすべてのSODのアイソフォームを反映する可能性がある：。細胞内SOD1、ミトコンドリアSOD2、および細胞外SOD3。このSODアッセイを含む、高感度の酵素アッセイ、12、タンパク質の交差汚染の可能性は可能であり、さらなる研究が必要です。エラーバーはSEMを示す。