Verwijderen van de ingewanden van de muis glasvocht en het netvlies voor Proteoom Analyses
Summary
De dissectie techniek illustreert ingewanden te ontdoen van het glasvocht, netvlies, en de lens van de muis oog, scheiding door centrifugeren, en karakterisering met eiwit assays.
Abstract
Terwijl de muis netvlies heeft zich ontpopt als een belangrijk genetisch model voor erfelijke retinale ziekten, de muis glasvocht moet nog worden onderzocht. Het glasvocht is een zeer waterige extracellulaire matrix bovenliggende het netvlies waar het intra-oculaire evenals extraoculaire eiwitten accumuleren tijdens ziekte. 1-3 Abnormale interacties tussen glasvocht en het netvlies liggen ten grondslag aan een aantal ziekten, zoals netvliesloslating, proliferatieve diabetische retinopathie, uveitis, en proliferatieve vitreoretinopathie 1. , 4 De relatieve muis glasvocht volume is aanzienlijk kleiner dan het menselijk glasvocht (figuur 1), aangezien de muis lens neemt bijna 75% van zijn oog. 5 Dit is biochemisch onderzoek van de muis glasvocht gemaakt uitdagend. In deze video artikel zullen we een techniek te ontleden en de muis glasvocht isoleren van het netvlies, waardoor het gebruik van transgene muis modellen om de rol van deze extracellulaire matrix duidelijker te definiëren in de ontwikkeling van vitreoretinale ziekten.
Protocol
Discussion
Transgene muizen zijn een belangrijk model voor het onderzoeken van het netvlies en vitreoretinale ziekte. 6-10 De muis glasachtig lichaam, echter, bestaat een aanzienlijk kleiner deel van het oog in vergelijking met de menselijke glasvocht door de grote lens in de muis oog. 5 Dit maakt het het moeilijk te isoleren en te zuiveren van de muis glasvocht. Inzicht in de eiwit veranderingen die gepaard gaan met het glasvocht tijdens ziekten zoals proliferatieve diabetische retinopathie, leeftijdsgebonden maculaire degeneratie, uveïtis, en netvliesloslating geven inzicht in de mechanismen waarmee zij de voortgang. Deze zichtbaar experimentele protocol biedt een middel te verkrijgen en te zuiveren van de muis glasachtig lichaam, terwijl het maximaliseren van het eiwit opbrengst voor enzymatische en proteomics analyses.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De financiering werd verstrekt door Fight for Sight en Onderzoek om blindheid te voorkomen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
|---|---|---|---|
| 15°, BD Beaver Microsurgical Blade | Becton-Dickinson | 374881 | |
| PBS, pH 7.4 | Invitrogen | 70011-044 | |
| 0.22 Fine-Castroviejo Suturing Forceps | Storz Ophthalmics | E1805 | |
| 0.12 Colibri forceps | Storz Ophthalmics | 2/132 | |
| Microcon Centrifugal Filter Ultracel YM-100 or YM-50 | Millipore | 42412, 42415 | |
| SOD Activity Colorimetric Assay Kit | Abcam | Ab65354 | |
| Weck-Cel surgical spears | Medtronic | 0008680 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11 836 170 001 | |
| Flamingo fluorescent gel stain | Bio-Rad | 161-04910 |
References
- Bishop, P. N. Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel. Prog. Retin. Eye Res. 19, 323-344 (2000).
- Gao, B. B., Chen, X., Timothy, N., Aiello, L. P. &. a. m. p. ;. a. m. p., Feener, E. P. Characterization of the vitreous proteome in diabetes without diabetic retinopathy and diabetes with proliferative diabetic retinopathy. J. Proteome Res. 7, 2516-2525 (2008).
- Izuta, H. Extracellular SOD and VEGF are increased in vitreous bodies from proliferative diabetic retinopathy patients. Mol. Vis. 15, 2663-2672 (2009).
- Sebag, J. Molecular biology of pharmacologic vitreolysis. Trans. Am. Ophthalmol. Soc. 103, 473-494 (2005).
- Smith, R. S., Smith, R. S., John, S. W. M., Nishina, P. M., Sundberg, J. P. . Systematic evaluation of the mouse eye: Anatomy, pathology, and biomethods. , 161-195 (2002).
- Ihanamaki, T., Metsaranta, M., Rintala, M., Vuorio, E., Sandberg-Lall, M. Ocular abnormalities in transgenic mice harboring mutations in the type II collagen gene. Eur. J. Ophthalmol. 6, 427-435 (1996).
- Kaarniranta, K. A mouse model for Stickler’s syndrome: ocular phenotype of mice carrying a targeted heterozygous inactivation of type II (pro)collagen gene (Col2a1. Exp. Eye Res. 83, 297-303 (2006).
- Marneros, A. G. &. a. m. p. ;. a. m. p., Olsen, B. R. Age-dependent iris abnormalities in collagen XVIII/endostatin deficient mice with similarities to human pigment dispersion syndrome. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 2367-2372 (2003).
- Martin, A. C. Pathogenesis of persistent hyperplastic primary vitreous in mice lacking the arf tumor suppressor gene. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45, 3387-3396 (2004).
- Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. S. Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy. Gene. Ther. Mol. Biol. 11B, 229-262 (2007).
- Skeie, J. M., Mahajan, V. B. Dissection of Human Vitreous Body Elements for Proteomic Analysis. J Vis Exp. , (2011).
- Ciechanowski, K. Impaired synthesis is not the reason for decreased activity of extracellular superoxide dismutase in patients with diabetes. Arch Med Res. 36, 148-153 (2005).
