Hücre olgunlaşması olmadan Dendritik Hücreler Verimli Transfeksiyon için optimize edilmiş Protokolü
Summary
Biz plazmid DNA hücresinin olgunlaşması neden olmaksızın veya siRNA birincil insan monosit türevli dendritik hücreler transfecting etkin bir yolu olarak optimize edilmiş yüksek verimli nucleofection protokol sunuyoruz. Biz daha başarılı bir şekilde hedef gen, mRNA ve protein seviyeleri hem de Rig-I siRNA susturulması için kanıt sağlar.
Abstract
Dendritik hücreler (DC), bağışıklık sisteminin başlatılması ve enfeksiyon 1 yanıt kritik bir rol oynayan nöbetçi olarak kabul edilebilir . Naif DC'ler tarafından patojenik antijen tespiti, patojen ilişkili moleküler desenleri (PAMPS) olarak adlandırılan özel korunmuş yapıları tanıyamaz örüntü tanıma reseptörleri (PRRs) geçer. DC'ler tarafından PAMPs Algılama olgun DC'lere aktivasyon ve dönüşüm sonuçlanabilecek bir hücre içi sinyal basamaklarını tetikler. Bu süreç genellikle diğer proinflamatuar sitokinlerin birlikte, tip 1 interferon üretimi ile karakterize, olgun T hücreleri ile etkileşim adaptif immün yanıt 2 başlatır drenaj lenf düğümleri, DC MHCII ve CD86 ve göç gibi hücre yüzey belirteçlerinin upregülasyonunun 3. Bu nedenle, DC'ler doğal ve adaptif bağışıklık sistemi bağlantısı.
Çeşitli patojenler DC tepkisi altında yatan moleküler ağlar incelemek için yetenek bu sinyal yollarının düzenlenmesi ve kaynaklı genlerin daha iyi anlaşılması için çok önemli. Bu aynı zamanda bulaşıcı hastalıklar ve tümörlere karşı DC tabanlı aşılar gelişimi kolaylaştırmak için yardımcı olacaktır. Ancak, bu araştırma çizgi ciddi zorluk birincil DC'ler 4 transfecting engellemiştir.
Virus lentiviral sistemi olarak iletimi yöntemleri, tipik olarak kullanılır, ancak bu karmaşıklık ve biyo-tehlikeli bir risk (ilgili maliyetler) 5,6,7,8 gibi birçok sınırlamalar taşır. Ayrıca, viral gen ürünleri teslim DC'ler 9,10,11,12 transduced immünojenite artar. Elektroporasyon karışık sonuçlar 13,14,15 ile kullanılan, ancak biz, yüksek verimli bir transfeksiyon protokol kullanım raporu ve kesin kendi programını göstermek için ilk olmuştur.
Bu yazıda, sınırlı hücre toksisitesi ve DC olgunlaşma (16) yokluğu, insan birincil DC'ler yüksek verim transfeksiyon için optimize edilmiş bir ticari protokol özetleyebiliriz . Transfeksiyon verimlilik (plazmid GFP) ve hücre canlılığı fazla sırasıyla% 50 ve% 70 idi. QRT-PCR IFNβ hiçbir upregülasyonu gösterdi FACS analizi, transfekte hücrelerde olgunlaşma belirteçlerinin CD86 ve MHCII ifade artış olmaması kurdu. Bu elektroporasyonu protokolü kullanarak, başarılı transfeksiyon DC'ler siRNA ve etkili hedeflenen gen yıkmak için kanıt sağlamak Rig-I mRNA ve protein seviyeleri hem de kilit bir virüs tanıma reseptör 16,17,.
Protocol
Discussion
Verimli naif birincil dendritik hücrelerin transfeksiyon, yüksek verimlilik analizi ve, doğuştan gelen adaptif bağışıklık geçiş aracılık bu anahtar hücre, hücresel inflamatuar yollarının tersine mühendislik için önemlidir. Ancak, çoğu araştırmacı bu hücrelerin standart transfeksiyon teknikleri kullanarak hem verimli ve transfeksiyon prosedürü inducing hücre olgunlaşması olmadan transfect zor olduğunu bulabilirsiniz. Bu sınırlamalar, eş zamanlı, bağımsız bir 96-iyi ticari nükleer t…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Proje NIH NIAID Sözleşme No HHSN2662000500021C tarafından desteklenmiştir. Ming Chen Biz onun teknik destek için teşekkür ederiz.
Materials
| Equipment/Reagent | Company | Catalogue # | Comments |
|---|---|---|---|
| Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle | Lonza | 108S0109 | Serial number |
| Amaxa Human Monocyte 96-well Nucleofector Kit | Lonza | VHPA-2007 | Contains the Human Monocyte 96-well Nucleofector Solution, the 96-well Supplement and the Nucleocuvettes and plates |
| RIG-I siRNA | Dharmacon | L-012511-00 | |
| GLO siRNA | Dharmacon | D-001600-01-20 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | Supplemented with 10% FCS, 2 mM L-glutamine, 100 U/ml penicillin and 100 μg/ml streptomycin to make DC growth medium |
| DMEM | Invitrogen | 11965 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070063 | |
| Fetal Calf Serum | HyClone | 3070.03 | |
| Dendritic Cells | New York Blood center | DCs are purified from buffy coats using a standard procedure |
References
- Reis e Sousa, C. Activation of dendritic cells: translating innate into adaptive immunity. Curr. Opin. Immunol. 16, 21-25 (2004).
- Bancherau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Clark, G. J. The role of dendritic cells in the innate immune system. Microbes Infect. 2, 257-272 (2000).
- Hamm, A. Efficient transfection method for primary cells. Tissue Eng. 8, 235-245 (2002).
- Henderson, R. A. Human dendritic cells genetically engineered to express high levels of the human epithelial tumor antigen mucin (MUC-1). Cancer Res. 56, 3763-3770 (1996).
- Reeves, M. E. Retroviral transduction of human dendritic cells with a tumor-associated antigen gene. Cancer Res. 56, 5672-5677 (1996).
- Aicher, . Successful retroviral mediated transduction of a reporter gene in human dendritic cells: feasibility of therapy with gene-modified antigen presenting cells. Exp. Hematol. 25, 39-44 (1997).
- Thomas, C. E. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat Rev Genet. 4, 346-358 (2003).
- Jooss, K. Transduction of dendritic cells by DNA viral vectors directs the immune response to transgene products in muscle fibers. J. Virol. 72, 4212-4223 (1998).
- Mitchell, D. A. RNA-transfected dendritic cells in cancer immunotherapy. J. Clin. Invest. 106, 1065-1069 (2000).
- Mincheff, M. In vivo transfection and/or cross-priming of dendritic cells following DNA and adenoviral immunizations for immunotherapy of cancer-changes in peripheral mononuclear subsets and intracellular IL-4 and IFN-gamma lymphokine profile. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 39, 125-132 (2001).
- Roth, . Helper-dependent adenoviral vectors efficiently express transgenes in human dendritic cells but still stimulate antiviral immune responses. J. Immunol. 169, 4651-4656 (2002).
- Tendeloo, V. F. V. a. n. Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells. Blood. 98, 49-56 (2001).
- Lenz, P. Nucleoporation of dendritic cells: efficient gene transfer by electroporation into human monocyte-derived dendritic cells. FEBS Lett. 538, 149-154 (2003).
- Prechtel, A. T. Small interfering RNA (siRNA) delivery into monocyte-derived dendritic cells by electroporation. J. Immunol. Methods. 311, 139-152 (2006).
- Bowles, R. Validation of efficient high-throughput plasmid and siRNA transfection of human monocyte-derived dendritic cells without cell maturation. J. Immunol. Methods. , .
- Kato, H. Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response. Immunity. 23, 19-28 (2005).
- Kato, H. Differential roles of MDA5 and RIG-I helicases in the recognition of RNA viruses. Nature. 441, 101-105 (2006).
- Haller, O. The Mx GTPase family of interferon-induced antiviral proteins. Microbes Infect. 9, 1636-1643 (2007).
