פרוטוקול אופטימיזציה עבור transfection יעילה של תאים דנדריטים ללא ההבשלה Cell
Summary
אנו מציגים תפוקה גבוהה פרוטוקול אופטימיזציה שלנו nucleofection כדרך יעילה של transfecting העיקרי האדם מונוציטים הנגזרות תאים דנדריטים עם ה-DNA או פלסמיד siRNA או ללא גרימת התבגרות התא. בנוסף, אנו מספקים ראיות השתקת siRNA מוצלח של הגן ממוקד חבל, אני ב-mRNA והן רמות החלבון.
Abstract
תאים דנדריטים (DCS) יכול להיחשב זקיפים של המערכת החיסונית אשר לשחק תפקיד קריטי בייזום שלה בתגובה לזיהום 1. זיהוי של אנטיגן פתוגניים ידי DCs נאיבית היא באמצעות הכרה קולטנים דפוס (PRRs) אשר מסוגלים לזהות מבנים ישומרו ספציפי המכונה הפתוגן הקשורים דפוסים מולקולריים (PAMPS). גילוי PAMPs ידי DCs מפעילה מפל איתות תאיים והתוצאה ההפעלה שלהם טרנספורמציה כדי DCs בוגרת. תהליך זה מאופיין בדרך כלל יחד עם ציטוקינים מעודדי דלקת אחרים על ידי ייצור של אינטרפרון מסוג 1, upregulation של תא השטח סמנים כגון MHCII ו CD86 והגירה של DC הבוגרת לבלוטות הלימפה לנקז, שבה האינטראקציה עם בתאי T מפעילה את התגובה החיסונית אדפטיבית 2, 3. לפיכך, DCs הקישור מערכות החיסון המולדת ובעלי כושר הסתגלות.
היכולת לנתח את רשתות המולקולריים שבבסיס התגובה DC לפתוגנים שונים חיוני להבנה טובה יותר של ויסות של מסלולים אלו איתות גנים המושרה שלהם. זה אמור גם לעזור להקל על פיתוח של DC מבוסס חיסונים נגד מחלות זיהומיות וגידולים. עם זאת, הקו הזה של המחקר כבר הקשתה קשות הקושי העיקרי transfecting DCs 4.
התמרה וירוס שיטות, כגון מערכת lentiviral, משמשים בדרך כלל, אבל לשאת מגבלות רבות כגון המורכבות ביו מסוכנים סיכון (עם העלויות הכרוכות) 5,6,7,8. בנוסף, אספקת המוצרים גנטי נגיפי מעלה את immunogenicity של אלה transduced DCs 9,10,11,12. Electroporation נעשה שימוש עם תוצאות מעורבות 13,14,15, אבל אנחנו הראשונים לדווח על השימוש בפרוטוקול תפוקה גבוהה transfection ו משמעי להפגין השירות שלה.
בדוח זה אנו מסכמים פרוטוקול מסחרי אופטימיזציה עבור transfection תפוקה גבוהה של DCs ראשוני האדם, עם רעילות לתא מוגבלת והעדר התבגרות DC 16. יעילות transfection (של ה-GFP הפלסמיד) ואת כדאיות התא היו יותר מ 50% ו -70% בהתאמה. FACS ניתוח הקים את העדר עלייה ביטוי של סמני הבשלה CD86 ו MHCII בתאים transfected, בעוד qRT-PCR הפגינו שום upregulation של IFNβ. שימוש בפרוטוקול זה electroporation, אנו מספקים ראיות transfection מוצלח של DCs עם siRNA ויעיל להפיל של הגן ממוקד תלבושת-I, קולטן מפתח זיהוי נגיפי 16,17, ב-mRNA והן רמות החלבון.
Protocol
Discussion
Transfection יעיל של נאיביות תאים דנדריטים הראשוני חשוב לניתוח תפוקה גבוהה הנדסה לאחור של מסלולים דלקתיים הסלולר בתא מפתח זה מתווך את המעבר מולדת-אדפטיבית החיסונית. עם זאת, רוב החוקרים מוצאים כי התאים האלה קשה transfect הן ביעילות וללא הליך התבגרות transfection גרימת התא כאשר שימוש …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
הפרויקט נתמך על ידי NIH NIAID חוזה מס 'HHSN2662000500021C. אנו מודים מינג צ'ן סיוע טכני שלו.
Materials
| Equipment/Reagent | Company | Catalogue # | Comments |
|---|---|---|---|
| Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle | Lonza | 108S0109 | Serial number |
| Amaxa Human Monocyte 96-well Nucleofector Kit | Lonza | VHPA-2007 | Contains the Human Monocyte 96-well Nucleofector Solution, the 96-well Supplement and the Nucleocuvettes and plates |
| RIG-I siRNA | Dharmacon | L-012511-00 | |
| GLO siRNA | Dharmacon | D-001600-01-20 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | Supplemented with 10% FCS, 2 mM L-glutamine, 100 U/ml penicillin and 100 μg/ml streptomycin to make DC growth medium |
| DMEM | Invitrogen | 11965 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070063 | |
| Fetal Calf Serum | HyClone | 3070.03 | |
| Dendritic Cells | New York Blood center | DCs are purified from buffy coats using a standard procedure |
References
- Reis e Sousa, C. Activation of dendritic cells: translating innate into adaptive immunity. Curr. Opin. Immunol. 16, 21-25 (2004).
- Bancherau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Clark, G. J. The role of dendritic cells in the innate immune system. Microbes Infect. 2, 257-272 (2000).
- Hamm, A. Efficient transfection method for primary cells. Tissue Eng. 8, 235-245 (2002).
- Henderson, R. A. Human dendritic cells genetically engineered to express high levels of the human epithelial tumor antigen mucin (MUC-1). Cancer Res. 56, 3763-3770 (1996).
- Reeves, M. E. Retroviral transduction of human dendritic cells with a tumor-associated antigen gene. Cancer Res. 56, 5672-5677 (1996).
- Aicher, . Successful retroviral mediated transduction of a reporter gene in human dendritic cells: feasibility of therapy with gene-modified antigen presenting cells. Exp. Hematol. 25, 39-44 (1997).
- Thomas, C. E. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat Rev Genet. 4, 346-358 (2003).
- Jooss, K. Transduction of dendritic cells by DNA viral vectors directs the immune response to transgene products in muscle fibers. J. Virol. 72, 4212-4223 (1998).
- Mitchell, D. A. RNA-transfected dendritic cells in cancer immunotherapy. J. Clin. Invest. 106, 1065-1069 (2000).
- Mincheff, M. In vivo transfection and/or cross-priming of dendritic cells following DNA and adenoviral immunizations for immunotherapy of cancer-changes in peripheral mononuclear subsets and intracellular IL-4 and IFN-gamma lymphokine profile. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 39, 125-132 (2001).
- Roth, . Helper-dependent adenoviral vectors efficiently express transgenes in human dendritic cells but still stimulate antiviral immune responses. J. Immunol. 169, 4651-4656 (2002).
- Tendeloo, V. F. V. a. n. Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells. Blood. 98, 49-56 (2001).
- Lenz, P. Nucleoporation of dendritic cells: efficient gene transfer by electroporation into human monocyte-derived dendritic cells. FEBS Lett. 538, 149-154 (2003).
- Prechtel, A. T. Small interfering RNA (siRNA) delivery into monocyte-derived dendritic cells by electroporation. J. Immunol. Methods. 311, 139-152 (2006).
- Bowles, R. Validation of efficient high-throughput plasmid and siRNA transfection of human monocyte-derived dendritic cells without cell maturation. J. Immunol. Methods. , .
- Kato, H. Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response. Immunity. 23, 19-28 (2005).
- Kato, H. Differential roles of MDA5 and RIG-I helicases in the recognition of RNA viruses. Nature. 441, 101-105 (2006).
- Haller, O. The Mx GTPase family of interferon-induced antiviral proteins. Microbes Infect. 9, 1636-1643 (2007).
