Summary

Оптимизированный протокол для эффективной трансфекции дендритных клеток без сотового Созревание

Published: July 08, 2011
doi:

Summary

Мы представляем наш оптимизированный для высокой пропускной nucleofection протокол как эффективный способ трансфекции первичных человеческих моноцитарных дендритные клетки либо с плазмидой ДНК или миРНК, не вызывая клетка созревания. Мы также предоставить доказательства для успешного глушителей миРНК целевой ген RIG-I как на РНК и белка.

Abstract

Дендритные клетки (ДК) можно рассматривать часовых иммунной системы, которые играют важнейшую роль в его возбуждении и реакции на инфекцию 1. Обнаружение патогенных антигена наивно домена через распознавания образов рецепторы (РРСС), которые способны распознавать определенные сохраняющиеся структуры называются патоген-связанные молекулярные модели (PAMPS). Обнаружение PAMPs по РС вызывает внутриклеточный сигнальный каскад в результате чего их активации и перехода к зрелой DC. Этот процесс, как правило, характеризуется производство интерферона типа 1, наряду с другими провоспалительных цитокинов, регуляция клеточных поверхностных маркеров, таких как MHCII и CD86 и миграцию зрелых постоянного тока для слива лимфатические узлы, где взаимодействие с Т-клетки, инициирует адаптивного иммунного ответа 2, 3. Таким образом, контроллеры домена ссылку врожденной и адаптивной иммунной системы.

Способность анализировать молекулярные сети постоянного тока основной ответ на различные патогенные имеет решающее значение для лучшего понимания регулирование этих сигнальных путей и их индуцированных генов. Он также должен способствовать развитию округ Колумбия, вакцин против инфекционных заболеваний и опухолей. Тем не менее, это направление было сильно мешают трудности трансфекции первичных контроллерах домена 4.

Вирус трансдукции методы, такие как лентивирусов системы, как правило, используются, но имеют много ограничений, таких как сложность и биологически опасных рисков (с соответствующими затратами) 5,6,7,8. Кроме того, доставка продуктов вирусного гена увеличивает иммуногенность тех трансдуцированных домена 9,10,11,12. Электропорация была использована со смешанными результатами 13,14,15, но мы первыми сообщили использование высокой пропускной трансфекции протокол и убедительно доказать свою полезность.

В этом докладе мы суммируем оптимизированных коммерческих протокол для высокой пропускной трансфекции первичных человеческих DC, с ограниченным токсичности клеток и отсутствие постоянного созревания 16. Трансфекция эффективности (GFP из плазмиды) и жизнеспособности клеток были более чем на 50% и 70% соответственно. FACS анализ установленных отсутствие увеличения выражение созревание маркеров CD86 и MHCII в трансфекции клеток, а QRT-PCR, не выявили регуляция IFNβ. Используя этот протокол электропорации, мы предоставляем доказательства для успешной трансфекции миРНК с контроллерами домена и эффективной сбить целевой ген RIG-I, ключевых вирусных рецепторов признание 16,17, как на РНК и белка.

Protocol

1. Программа Amaxa 96 и трансфер Nucleofector Откройте новый файл параметров. Выберите количество скважин вы будете использовать для стандартных трансфекции, перемещая курсор на 96 лунок диаграмме пластины. Используйте не менее 3 скважин бассейн для каждого экспериментального образц?…

Discussion

Эффективность трансфекции наивно первичных дендритных клеток имеет важное значение для высокой пропускной способности и анализа инженерный клеточных воспалительных путей в этой ключевой ячейки посредническую врожденной-адаптивной иммунной перехода. Тем не менее, большинство иссл?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Проект был поддержан NIH NIAID контракт № HHSN2662000500021C. Мы благодарим Мин Чена за его техническую помощь.

Materials

Equipment/Reagent Company Catalogue # Comments
Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle Lonza 108S0109 Serial number
Amaxa Human Monocyte 96-well Nucleofector Kit Lonza VHPA-2007 Contains the Human Monocyte 96-well Nucleofector Solution, the 96-well Supplement and the Nucleocuvettes and plates
RIG-I siRNA Dharmacon L-012511-00  
GLO siRNA Dharmacon D-001600-01-20  
RPMI 1640 Invitrogen 11875 Supplemented with 10% FCS, 2 mM L-glutamine, 100 U/ml penicillin and 100 μg/ml streptomycin to make DC growth medium
DMEM Invitrogen 11965  
L-glutamine Invitrogen 25030081  
Penicillin/streptomycin Invitrogen 15070063  
Fetal Calf Serum HyClone 3070.03  
Dendritic Cells New York Blood center   DCs are purified from buffy coats using a standard procedure

References

  1. Reis e Sousa, C. Activation of dendritic cells: translating innate into adaptive immunity. Curr. Opin. Immunol. 16, 21-25 (2004).
  2. Bancherau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
  3. Clark, G. J. The role of dendritic cells in the innate immune system. Microbes Infect. 2, 257-272 (2000).
  4. Hamm, A. Efficient transfection method for primary cells. Tissue Eng. 8, 235-245 (2002).
  5. Henderson, R. A. Human dendritic cells genetically engineered to express high levels of the human epithelial tumor antigen mucin (MUC-1). Cancer Res. 56, 3763-3770 (1996).
  6. Reeves, M. E. Retroviral transduction of human dendritic cells with a tumor-associated antigen gene. Cancer Res. 56, 5672-5677 (1996).
  7. Aicher, . Successful retroviral mediated transduction of a reporter gene in human dendritic cells: feasibility of therapy with gene-modified antigen presenting cells. Exp. Hematol. 25, 39-44 (1997).
  8. Thomas, C. E. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat Rev Genet. 4, 346-358 (2003).
  9. Jooss, K. Transduction of dendritic cells by DNA viral vectors directs the immune response to transgene products in muscle fibers. J. Virol. 72, 4212-4223 (1998).
  10. Mitchell, D. A. RNA-transfected dendritic cells in cancer immunotherapy. J. Clin. Invest. 106, 1065-1069 (2000).
  11. Mincheff, M. In vivo transfection and/or cross-priming of dendritic cells following DNA and adenoviral immunizations for immunotherapy of cancer-changes in peripheral mononuclear subsets and intracellular IL-4 and IFN-gamma lymphokine profile. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 39, 125-132 (2001).
  12. Roth, . Helper-dependent adenoviral vectors efficiently express transgenes in human dendritic cells but still stimulate antiviral immune responses. J. Immunol. 169, 4651-4656 (2002).
  13. Tendeloo, V. F. V. a. n. Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells. Blood. 98, 49-56 (2001).
  14. Lenz, P. Nucleoporation of dendritic cells: efficient gene transfer by electroporation into human monocyte-derived dendritic cells. FEBS Lett. 538, 149-154 (2003).
  15. Prechtel, A. T. Small interfering RNA (siRNA) delivery into monocyte-derived dendritic cells by electroporation. J. Immunol. Methods. 311, 139-152 (2006).
  16. Bowles, R. Validation of efficient high-throughput plasmid and siRNA transfection of human monocyte-derived dendritic cells without cell maturation. J. Immunol. Methods. , .
  17. Kato, H. Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response. Immunity. 23, 19-28 (2005).
  18. Kato, H. Differential roles of MDA5 and RIG-I helicases in the recognition of RNA viruses. Nature. 441, 101-105 (2006).
  19. Haller, O. The Mx GTPase family of interferon-induced antiviral proteins. Microbes Infect. 9, 1636-1643 (2007).

Play Video

Cite This Article
Bowles, R., Patil, S., Pincas, H., Sealfon, S. C. Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation. J. Vis. Exp. (53), e2766, doi:10.3791/2766 (2011).

View Video