Summary

Protocollo ottimizzato per Transfection efficiente delle cellule dendritiche, senza la maturazione delle cellule

Published: July 08, 2011
doi:

Summary

Vi presentiamo il nostro sito ottimizzato high-throughput protocollo nucleofection come un modo efficace di trasfezione delle cellule dendritiche umane primarie derivate da monociti sia con DNA plasmidico o siRNA senza provocare la maturazione delle cellule. Abbiamo inoltre fornire le prove per il silenziamento del gene siRNA successo mirati RIG-I, sia a livelli di mRNA e proteine.

Abstract

Le cellule dendritiche (DC) può essere considerato sentinelle del sistema immunitario che svolgono un ruolo critico nella sua iniziazione e la risposta alle infezioni 1. Rilevazione dell'antigene patogeni da DC ingenuo è attraverso i recettori pattern recognition (PRR) che sono in grado di riconoscere specifiche strutture conservate denominate modelli molecolari patogeni associati (PAMPs). Rilevazione di PAMPs da DC innesca una cascata di segnalazione intracellulare con conseguente loro attivazione e la trasformazione di DC mature. Questo processo è tipicamente caratterizzata da produzione di interferone di tipo 1 insieme ad altre citochine proinfiammatorie, sovraregolazione di marcatori cellulari di superficie come MHCII e CD86 e la migrazione delle DC mature ai linfonodi drenanti, dove l'interazione con le cellule T avvia la risposta immunitaria adattativa 2, 3. Così, DC collegare i sistemi immunitario innato e adattativo.

La capacità di sezionare le reti molecolari alla base della risposta DC a vari agenti patogeni è fondamentale per una migliore comprensione del regolamento di queste vie di segnalazione e le loro geni indotti. Dovrebbe anche contribuire a facilitare lo sviluppo di DC-based vaccini contro le malattie infettive e tumori. Tuttavia, questa linea di ricerca è stato gravemente ostacolato dalla difficoltà di trasfezione primario DC 4.

Metodi di trasduzione del virus, come il sistema lentivirale, sono tipicamente utilizzati, ma portano molti limiti come la complessità e bio-pericolosi rischio (con i costi associati) 5,6,7,8. Inoltre, la consegna dei prodotti gene virale aumenta l'immunogenicità di coloro trasdotte DC 9,10,11,12. Elettroporazione è stata utilizzata con risultati alterni 13,14,15, ma siamo i primi a segnalare l'utilizzo di un high-throughput protocollo di trasfezione e definitivamente dimostrare la sua utilità.

In questa relazione si riassumono un protocollo ottimizzato commerciale high-throughput per la transfezione di DC umane primarie, con limitata tossicità delle cellule e l'assenza di maturazione DC 16. L'efficienza di trasfezione (di plasmide GFP) e la vitalità delle cellule erano più del 50% e 70% rispettivamente. FACS analisi stabilito l'assenza di aumento di espressione della maturazione e MHCII marker CD86 in cellule trasfettate, mentre qRT-PCR ha dimostrato di non sovraregolazione IFNβ. Usando questo protocollo di elettroporazione, forniamo le prove per la trasfezione di successo di DC con siRNA ed efficace di abbattere genica mirata RIG-I, un recettore chiave riconoscimento virale 16,17, sia a livelli di mRNA e proteine.

Protocol

1. Programmare il Amaxa 96 pozzetti navetta Nucleofector Aprire un nuovo file di parametri. Selezionare il numero di pozzi che verrà utilizzato per la trasfezione di serie trascinando il cursore sul diagramma 96 pozzetti. Usare un minimo di 3 pozzi di piscina per ogni campione sperimentale. Inserire il codice del programma: in part1 selezionare 'FF' e in part2 selezionare '168 'dal menu a discesa Dalla soluzione casella di selezione 'Monocita, umano' </li…

Discussion

Trasfezione efficiente ingenuo cellule dendritiche primario è importante per l'analisi di un elevato throughput e reverse engineering di cellulari vie infiammatorie in questa cellula fondamentale della mediazione innata-adaptive transizione del sistema immunitario. Tuttavia, la maggior investigatori scoprire che queste cellule sono di difficile trasfezione in modo efficiente e senza la maturazione di transfezione delle cellule procedura di induzione quando si utilizzano tecniche di trasfezione standard. Abbiamo stu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Il progetto è stato sostenuto da NIH Contratto NIAID No. HHSN2662000500021C. Ringraziamo Ming Chen per la sua assistenza tecnica.

Materials

Equipment/Reagent Company Catalogue # Comments
Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle Lonza 108S0109 Serial number
Amaxa Human Monocyte 96-well Nucleofector Kit Lonza VHPA-2007 Contains the Human Monocyte 96-well Nucleofector Solution, the 96-well Supplement and the Nucleocuvettes and plates
RIG-I siRNA Dharmacon L-012511-00  
GLO siRNA Dharmacon D-001600-01-20  
RPMI 1640 Invitrogen 11875 Supplemented with 10% FCS, 2 mM L-glutamine, 100 U/ml penicillin and 100 μg/ml streptomycin to make DC growth medium
DMEM Invitrogen 11965  
L-glutamine Invitrogen 25030081  
Penicillin/streptomycin Invitrogen 15070063  
Fetal Calf Serum HyClone 3070.03  
Dendritic Cells New York Blood center   DCs are purified from buffy coats using a standard procedure

References

  1. Reis e Sousa, C. Activation of dendritic cells: translating innate into adaptive immunity. Curr. Opin. Immunol. 16, 21-25 (2004).
  2. Bancherau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
  3. Clark, G. J. The role of dendritic cells in the innate immune system. Microbes Infect. 2, 257-272 (2000).
  4. Hamm, A. Efficient transfection method for primary cells. Tissue Eng. 8, 235-245 (2002).
  5. Henderson, R. A. Human dendritic cells genetically engineered to express high levels of the human epithelial tumor antigen mucin (MUC-1). Cancer Res. 56, 3763-3770 (1996).
  6. Reeves, M. E. Retroviral transduction of human dendritic cells with a tumor-associated antigen gene. Cancer Res. 56, 5672-5677 (1996).
  7. Aicher, . Successful retroviral mediated transduction of a reporter gene in human dendritic cells: feasibility of therapy with gene-modified antigen presenting cells. Exp. Hematol. 25, 39-44 (1997).
  8. Thomas, C. E. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat Rev Genet. 4, 346-358 (2003).
  9. Jooss, K. Transduction of dendritic cells by DNA viral vectors directs the immune response to transgene products in muscle fibers. J. Virol. 72, 4212-4223 (1998).
  10. Mitchell, D. A. RNA-transfected dendritic cells in cancer immunotherapy. J. Clin. Invest. 106, 1065-1069 (2000).
  11. Mincheff, M. In vivo transfection and/or cross-priming of dendritic cells following DNA and adenoviral immunizations for immunotherapy of cancer-changes in peripheral mononuclear subsets and intracellular IL-4 and IFN-gamma lymphokine profile. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 39, 125-132 (2001).
  12. Roth, . Helper-dependent adenoviral vectors efficiently express transgenes in human dendritic cells but still stimulate antiviral immune responses. J. Immunol. 169, 4651-4656 (2002).
  13. Tendeloo, V. F. V. a. n. Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells. Blood. 98, 49-56 (2001).
  14. Lenz, P. Nucleoporation of dendritic cells: efficient gene transfer by electroporation into human monocyte-derived dendritic cells. FEBS Lett. 538, 149-154 (2003).
  15. Prechtel, A. T. Small interfering RNA (siRNA) delivery into monocyte-derived dendritic cells by electroporation. J. Immunol. Methods. 311, 139-152 (2006).
  16. Bowles, R. Validation of efficient high-throughput plasmid and siRNA transfection of human monocyte-derived dendritic cells without cell maturation. J. Immunol. Methods. , .
  17. Kato, H. Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response. Immunity. 23, 19-28 (2005).
  18. Kato, H. Differential roles of MDA5 and RIG-I helicases in the recognition of RNA viruses. Nature. 441, 101-105 (2006).
  19. Haller, O. The Mx GTPase family of interferon-induced antiviral proteins. Microbes Infect. 9, 1636-1643 (2007).

Play Video

Cite This Article
Bowles, R., Patil, S., Pincas, H., Sealfon, S. C. Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation. J. Vis. Exp. (53), e2766, doi:10.3791/2766 (2011).

View Video