والفحص ضوء بارد الكالسيوم عن التحليل الوظيفي من البعوض ( الزاعجة المصرية) والقراد ( مروحية الرأس المتثني) G - يقترن بروتين المستقبلات
Summary
هذا البروتوكول يوفر إرشادات لاختيار الخط نسيلي الخلية ومقايسة تلألؤ بيولوجي الكالسيوم لتحليل العلاقات بين الهيكل والنشاط من نيوروببتيد المفصلية توليفها على GPCRs المشابهة لها. ويمكن استخدام هذا الاختبار لمستقبلات deorphanization والدراسات العلاقة بين الهيكل والنشاط التمثيلي للتصميم الصناعي والببتيد / المخدرات يؤدي الاكتشاف.
Abstract
مستقبلات هرمون المفصلية هي الاهداف المحتملة لمبيدات الآفات الرواية كما أنها تنظم العديد من العمليات الفسيولوجية الأساسية والسلوكية. الغالبية منهم ينتمون إلى الفصيلة من مستقبلات البروتين يقترن G (GPCRs). فقد ركزنا على المستقبلات التي تميز كاينين المفصلية من القراد والبعوض. kinins المفصلية هي نيوروببتيد متعددة الوظائف مع myotropic ، مدر للبول ، ووظيفة الناقلات العصبية. هنا ، وهي طريقة لتحليل منهجي لهيكل والنشاط علاقات kinins الحشرات على كاينين غيروي two مستقبلات معربا عن النظم الموصوفة. ونحن نقدم معلومات مهمة ذات الصلة لوضع النظير كاينين biostable مع احتمال تعطيل مدر للبول ، myotropic ، و / أو عمليات الهضم في القراد والبعوض.
وأعرب عن ستابلي المستقبلات كاينين من قراد الأبقار جنوب العلس المتثني (Canestrini) ، وبعوض الزاعجة البعوض (لينيوس) ، في خط خلايا الثدييات CHO – K1. تم الانتهاء من التحليلات الفنية لهذه المستقبلات تلألؤ بيولوجي باستخدام لوحة فحص الكالسيوم الذي يقيس تلألؤ بيولوجي داخل الخلايا لتحديد مستويات الكالسيوم وبناء على طلب السيتوبلازمية الببتيد لهذه الخلايا المترابطة. هذا الأسلوب يستفيد من البروتين aequorin ، وهي معزولة عن photoprotein القناديل الانارة. نحن transfected عابر للaequorin البلازميد (mtAEQ/pcDNA1) في خطوط الخلايا التي عبرت عن ستابلي المستقبلات كاينين. ثم عولجت هذه الخلايا مع coelenterazine العامل المساعد ، والتي المجمعات مع aequorin داخل الخلايا. هذه السندات فواصل في وجود الكالسيوم ، التي تنبعث منها مستويات التلألؤ يدل على تركيز الكالسيوم. كما مستقبلات كاينين إشارات من خلال إطلاق الكالسيوم داخل الخلايا ، وترتبط شدة إشارة إلى قوة من الببتيد.
هذا البروتوكول هو تجميع لعدة بروتوكولات مع التعديلات التي سبق وصفها ، بل يقدم خطوة بخطوة تعليمات للتعبير مستقرة GPCRs في خط خلايا الثدييات من خلال فحوصات لوحة فنية (Staubly وآخرون ، 2002 واسطبلات وآخرون ، 1997. ). باستخدام هذه المنهجية ، كنا قادرين على وضع خطوط الخلية مستقرة معربا عن البعوض والقراد المستقبلات كاينين ، قارن وقوة kinins البعوض الثلاثة ، تحديد المواقف الحرجة من الأحماض الأمينية للتفاعل يجند مستقبلات ، وأداء شبه سرعة فحص الببتيد المكتبة. لأن الحشرات kinins عرضة للتدهور السريع الأنزيمية التي peptidases الذاتية ، فهي محدودة في استخدامها كأدوات لمكافحة الآفات أو دراسات الغدد الصماء. ولذلك ، فإننا أيضا اختبار النظير كاينين تحتوي على الحمض الأميني isobutyric (AIB) لتعزيز قوتها وbiostability. هذا التناظرية ببتيداز المقاوم يمثل تؤدي مهمة في تطوير biostable النظير الحشرات وكاينين قد تساعد في تطوير neuropeptide القائم على استراتيجيات مكافحة المفصليات.
Protocol
1. إنشاء خطوط الخلية مستقرة استنساخ GPCR اهتمامكم وأدخله متجه التعبير دمج تسلسل 5 'توافق كوزاك (GCCA / GCCATGG) حول بدء كودون الأمثل للربط الريباسي في نظام الثدييات (كوزاك ، 1986). هنا نستخدم pcDNA3.1/Bm-KR البلازميد لمستقبلات القراد كاينين ، وpcDNA3.1/Aedae-KR البلازميد لمستقبلات كاينين البعوض (هولمز وآخرون ، 2003 ؛. Pietrantonio وآخرون ، 2005). وpcDNA3.1 (–) ناقلات بترميز الأمبيسيلين مقاومة البكتيريا والتحديد في النيوميسين المقاومة (G418) لاختيار واحدة في خلايا الثدييات. CHO – K1 تنمو خلايا فارغة (بدون البلازميدات) (آي تي سي سي ، ماناساس ، فرجينيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) أو غيرها من خط الخلية المطلوب في قارورة T – 25 دينار بحريني (فالكون) على 37 درجة مئوية في حاضنة 5 ٪ CO 2 مرطب (هولمز وآخرون ، 2003). وينبغي أن يتم كل حضانات أخرى في ظل هذه الظروف ما لم ينص على خلاف ذلك. الحفاظ على خلايا فارغة في وسط نمو (F12K المتوسطة مع مصل بقري جنيني 10 ٪) مع المضادات الحيوية ، 1X مضاد فطري (Invitrogen ، CA). لتقسيم الخلايا ، الاحماء جميع الحلول الى 37 درجة مئوية. إزالة المتوسطة القديمة في قارورة T – 25 والشطف مع PBS 5 مل ثم قم بإزالة برنامج تلفزيوني. يعرض للتريبسين إلى الخلايا ، إضافة 2 مل PBS – التربسين – EDTA (34 مل PBS ، 2 مل بيكربونات الصوديوم 7.5 ٪ و 4 مل 10X التربسين – EDTA) لمدة 2 دقيقة. أضف 3 مل المتوسطة والمتوسطة نضح صعودا وهبوطا لمزج الخلايا. نقل المتوسطة مع الخلايا المخروطية في أنبوب وأجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في ~ 200-300 ز (1000 دورة في الدقيقة). تجاهل طاف واعادة تعليق الخلايا في المتوسط 5 مل. تمييع الخلايا معلق إلى تركيز 01:05 أو 01:10 المتوسطة مع الطازجة ونقل 5 مل في دورق T – 25 الجديدة. بعد الخلايا تنمو بشكل صحى (حوالي 2-3 أيام) ، وبذور الخلايا CHO – K1 إلى T – 25 قوارير زراعة الأنسجة وتنمو عليها بين عشية وضحاها في النمو دون المتوسط حتى المضادات الحيوية فهي متموجة حوالي 30 ٪ (حوالي 18 ساعة). ويمكن تحديد درجة confluency مراقبة من قبل خلايا تحت المجهر الفلورسنت مقلوب. اعداد الخلائط التالية لكل عينة : الجمع بين 1-2 ميكروغرام الحمض النووي (على سبيل المثال : استخدام 4μl pcDNA3.1/Aedae-KR 265μg/μl) مع 100 ميكرولتر OPTI – MEM أنا انخفاض متوسط المصل (Invitrogen). مزيج 6 الكاشف Lipofectin ميكرولتر (InvitrogenTM) إلى 100 ميكرولتر المتوسطة المصل F12K مجانا ، مما يجعل نسبة 1:1 من Lipofectin إلى الحمض النووي. يحضن في درجة حرارة الغرفة ل30-45 دقيقة. مزيج من الحلول بلطف مع 1.5.1 1.5.2 بطريقة حكيمة المنسدلة (الحجم الكلي = 200 ميكرولتر). دعونا نقف عند درجة حرارة الغرفة لمدة 10-15 دقيقة. إزالة المتوسطة النمو القديم من الخلايا وغسل الخلايا مع 5 مل مصل المتوسطة F12K الحرة ومن ثم إزالة المتوسطة المصل F12K الحرة. في أنبوب 15 مل ، مزج الخليط برفق ترنسفكأيشن إلى 1.8 مل من المتوسط F12K الطازجة بطريقة الانقطاع عن الحكمة. ثم تغسل الخلايا من الخطوة 1.5 مع إضافة برنامج تلفزيوني وهذا الحل ترنسفكأيشن جديدة إلى الخلايا. احتضان لمدة 18 ساعة. تغيير متوسطة إلى F12K المتوسطة بالإضافة إلى 10 ٪ مصل بقري جنيني من دون مضادات حيوية واحتضان بين عشية وضحاها. انقسام الخلايا في قوارير T – 25 مع اثنين المتوسطة F12K زائد 10 ٪ مصل بقري جنيني من دون مضادات حيوية لمدة 18 ساعة (لتقسيم الخلايا الرجاء راجع الخطوة 1.3). استبدال المتوسطة مع المتوسط انتقائية (F12K المتوسطة بالإضافة إلى 10 ٪ مع مصل بقري جنيني GENETICIN 800μg/ml ، Invitrogen). ثقافة الخلايا باستخدام وسيلة انتقائية لمدة 3-4 أسابيع. مع مرور الوقت فإن هذا الاختيار لخلايا التي أدرجت في ستابلي البلازميد الى عينات من الحمض النووي الجيني. مواصلة الحفاظ على الخلايا باستخدام المتوسط الصيانة (F12K المتوسطة بالإضافة إلى 10 ٪ مع مصل بقري جنيني GENETICIN 400μg/ml). تجميد خطوط الخلايا دوريا مع نسبة 1:1 وسائل الإعلام تجميد (وسط انتقائية مع DMSO 20 ٪) لمنع يفقد في حالة تلوث غير متوقع. اختيار خطوط الخلايا نسيلي : كخطوة أولى ، ويعرض للتريبسين الطرد المركزي الخلايا من الخطوة مع 1.8 المتوسطة الصيانة كما في الخطوة 1.3. اعادة تعليق الخلايا في 5 مل المتوسطة الصيانة ، وتأخذ 0.5 مل من الخلية تعليق وإضافة 4.5 مل من المتوسط صيانة جديدة لجعل تخفيف 10X. نقل الى تخفيف 10X 12 بئرا من 96 لوحة جيدا ، مضيفا أن كل 100 ميكرولتر جيدا لاختيار واحد للخلايا. مواصلة بذل التخفيفات المتسلسلة 10X من هذه الخلايا لتعليق نهائي النظري للخلية واحدة لكل 100 ميكرولتر (عادة التخفيف النهائية ستكون في حدود 10 -11 و 10 -19 ، والعدد الإجمالي للالتخفيفات المسلسل هو ~ 10X 19) . مباشرة بعد كل التخفيف ، ونقل 100 ميكرولتر من التخفيف في 12 بئرا من 96 لوحة جيدا. حضانة بعد 18 ساعة ، 96 لوحات مراقبة جيدا تحت الضوء المعكوس أو مضان المجهر والآبار التي تظهر العلامة فقط تحتوي على خلية واحدة أو تحتوي على خليتين من الواضح أن تنقسم من خلية واحدة. إبقاء مراقبة كل يوم والمتوسطة تغير كل ثلاثة أيام. عندما الآبار conflu 80 ٪الأنف والحنجرة (حوالي أسبوع) ، وشطف الآبار ملحوظ مع 200 برنامج تلفزيوني يعرض للتريبسين ميكرولتر ولهم مع 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني ، التربسين – EDTA الحل. نقل الخلايا من كل علامة جيدة في بئر واحدة من لوحة 6 – جيدا مع 1 مل المتوسط الصيانة. تنمو هذه الخلايا لمدة 3 أيام ثم نقل الخلايا في قارورة T25 الفردية. اختبار هذه الخلايا باستخدام مقايسة تلألؤ بيولوجي الكالسيوم مع الببتيدات ناهض (انظر القسم 2). حدد 1 خط خلية من الخطوة وفقا لأعلى 1.11 في استجابة لوحة فحص الكالسيوم تلألؤ بيولوجي وأداء للمرة الثانية في اختيار الخطوات التالية خلية واحدة 1،9-1،11. تجميد دوريا خطوط الخلية. من الاختيار الثانوي هو موضح في الخطوة 1.12 ، اختيار خطوط الخلايا 2-3 مع الاستجابة في أعلى لوحة فحص الكالسيوم تلألؤ بيولوجي والمحافظة عليها في الثقافة لمزيد من الكالسيوم لوحة المقايسات تلألؤ بيولوجي. تتبع أرقام مرور. من وقت لآخر ، وتجميد خطوط الخلية من الممرات في وقت مبكر بحيث يمكنك دائما العودة إليها إذا كانت خطوط الخلايا مع أكثر الممرات وقف تنفيذ باستمرار. 2. لوحة تلألؤ بيولوجي الكالسيوم مقايسة Ligate الجين مراسل الفائدة الى ناقلات التعبير. المستخدمة هنا نحن aequorin mtAEQ/pcDNA1 البلازميد (هدية من Grimmelikhuijzen CJP الدكاترة. مايكل وليامسون و، جامعة كوبنهاغن ، الدانمرك). تحويل البلازميد في E. القولونية الخلايا MC1061/PS (Invitrogen) وتنقيتها باستخدام تدور QIAprep miniprep مجموعة (Qiagen شركة). في الخطوة النهائية في أزل البلازميد مع تريس العازلة دون EDTA ، وليس الماء. خطوط الخلايا تنمو من الخطوة تعبر عن مستقبلات 1.13 في المتوسط المطلوب صيانتها. عندما الخلايا هي 90 ٪ متموجة ، يعرض للتريبسين ، ثم الطرد المركزي واعادة تعليق الخلايا في 5 مل المتوسطة الصيانة كما في الخطوة 1.3. تمييع الخلايا (10X حول المتوسط مع الصيانة) والعد عدد الخلايا مع خلية مكافحة (برايت الخط عدادة الكريات) تحت المجهر. (وأظهر متوسط 20 خلايا في واحدة من 9 في المربعات عدادة الكريات) ضبط عدد الخلايا إلى خلايا حوالي 2 × 5 10 / مل. 2 مل خلايا البذور مخففة في وسائل الإعلام في كل جانب من لوحة six جيدا. احتضان لمدة 24 ساعة (الخلايا ينبغي أن تصل إلى حوالي 60 ٪ بعد confluency الحضانة). تغيير وسائل الإعلام في لوحة الآبار 6 إلى OPTI – MEM المتوسط. لكل بئر ، مزيج من 96 ميكرولتر OPTI – MEM مع 4 كاشف FuGENE ميكرولتر ترنسفكأيشن 6 (روش الكيميائية الحيوية) في أنبوب microfuge وترك الجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. إضافة 1 ميكروغرام من الحمض النووي aequorin 1 / pcDNA البلازميد في كل أنبوب ثم يهز بلطف العينة : 1 دقيقة ، ويحضن في درجة حرارة الغرفة لدقائق 15-20. إضافة كل المزيج في كل بئر بأسلوب قطرة قطرة في حين تهز برفق لوحة جيدا. احتضان لوحات لمدة 6 ساعات وتغير على المدى المتوسط والمتوسطة F12K تحتوي على 10 ٪ مصل بقري جنيني بدون المضادات الحيوية. بعد حضانة الخلايا في ستة لوحة جيدا لمدة 24 ساعة ، يعرض للتريبسين ، الطرد المركزي واعادة تعليق الخلايا كخطوة 1.3. حساب عدد الخلايا إلى 400000 خلية / مل كخطوة 2.1 ونقل 100 ميكرولتر (مجموع 40000 cells/100 ميكرولتر) في كل بئر 96 – جيدا بيضاء رقيقة أسفل لوحة microtitre (Costar 3610). احتضان لمدة 24 ساعة حتى حوالي 80 ٪ confluency الخلية. هذا هو تركيز الأمثل للخلايا للمقايسة تلألؤ بيولوجي. تعد وسائل الإعلام 90μl/well DMEM الكالسيوم الخالية (Invitrogen) تحتوي على 5 coelenterazine ميكرومتر (Invitrogen) في الظلام (coelenterazine خفيف الحساسة). تأخذ لوحة من 2.4 ، وإزالة وسائل الإعلام القديمة وإضافة إلى كل هذا 90μl جيدا. احتضان لوحات لمدة 3 ساعات في الظلام عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2 ، وبعد ذلك الخلايا الموجودة في لوحة جاهزة للاختبار. 3. عملية الصك وتحليل البيانات كل قارئ لوحة تلألؤ بيولوجي مختلف. نحن لدينا تجربة أداء باستخدام قارئ NOVOstar لوحة (Labtechnologies BMG) في وضع bioluminensence. إذا كنت تستخدم أداة مختلفة ، ويجب التكيف مع هذا البروتوكول. تطهير مضخات لوحة القارئ (أو مضخات PRIME) قبل استخدامها. أطفئي الضوء في الغرفة قبل وضع لوحة على حامل لوحة. مرة واحدة لصاحب اللوحة قد أغلقت ، وتحويل الأضواء. Solubilize الببتيد (في أنبوب إيبندورف 1.5 مل) في وسائل الإعلام DMEM الكالسيوم الخالية. تعيين "نضح العمق" و "لتحديد المواقع" من الحل الببتيد قبل الاستخدام. التحدي الخلايا مع 10 ميكرولتر (10X) من تركيزات مختلفة من الببتيدات (FFFSWG – NH2 ، الزاعجة – K1 – 3 ، أو غيرها من الببتيد المطلوب) والبدء فورا في تسجيل انبعاث الضوء. وضعنا أداة لتسجيل انبعاث الضوء (465 نانومتر) لكل بئر 2 ثانية عن كل مرة من مجموع 50 ثانية. تأكد لتشمل مراقبة إيجابية مثل التناظرية النشط (وقد استخدم التناظرية FFFSWGa ، تانيجا – Bageshwar وآخرون ، 2009) والتحكم سلبية مثل الخلايا ناقلات transfected فقط. سوف يكون من الضروري مراقبة سلبية خلال تحليل البيانات لتحديد العتبة الأساسية (راجع النتائج التمثيلية).ويمكن أيضا أن لا علاقة لها ، الببتيد نشط تضاف كعنصر تحكم سلبية. بعد اكتمال تشغيل ، وغسل المضخة الصك (أو مضخات PRIME) ثم ضع عينتك الببتيد المقبل. حفظ البيانات الخاصة بك ، ويغسل مضخات مرة أخرى. معالجة البيانات : نقل البيانات من انبعاث الضوء من كل بئر في ورقة بيانات Microsoft Excel. لصق البيانات من Excel إلى 4.0 من برنامج بريزم GraphPad برمجيات شركة (سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة). تركيزات مختلفة الببتيد هو المحور السيني وحدات تلألؤ بيولوجي هو محور Y. لتطبيع البيانات ورسم منحنى سجل للاستجابة. حدد منحنى الانحدار غير الخطية تحليل تناسب (السيني الاستجابة للجرعة معادلة الانحدار مع متغير) للحصول على التركيز والاستجابة لكل الببتيد المنحنيات. المؤامرات البرنامج القيم في النهاية ويعطي EC 50. يجب أن يتكرر ثلاث مرات كل تجربة لتحليل البيانات. 4. ممثل النتائج : تصرفت الزاعجة البعوض مستقبلات كاينين بعوض عند المعبر عنها في خلايا K1 CHO ، على مستقبلات multiligand وأجاب وظيفيا لتركيزات منخفضة تصل إلى 1 نانومتر من kinins three الزاعجة endogenours ، Aedae kinins 1-3 ، واختبارها باستخدام لوحة منفردة تلألؤ بيولوجي فحص الكالسيوم . الشكل 1 يبين أن النظام رتبة الفاعلية التي حصل عليها Aedae – K – 3> Aedae – K – 2> Aedae – K – 1 ، استنادا إلى قيم كل من المفوضية الأوروبية 50 – 3 – K Aedae ، 16.04 نانومتر ؛ Aedae – K – 2 ، 26.6 نانومتر ، وAedae – K – 1 ، 48.85 نانومتر ، والتي كانت تختلف اختلافا كبيرا إحصائيا (P <0.05) (Pietrantonio وآخرون ، 2005). علينا أيضا أن تستخدم هذا الاختبار لتحديد بقايا كاينين حاسمة للتفاعل مستقبلات الببتيد كاينين. الحشرات الببتيدات كاينين مشاركة خماسي الببتيد C – المحطة التي تمثل الحد الأدنى من تسلسل المطلوبة للنشاط بيولوجي ، والمعروف أيضا باسم الأساسية. في الجدول رقم 1 ، تم توليفها جوهر الببتيد كاينين النظير باعتبارها سلسلة من استبدال ألانين FFSWGa الأساسية خماسي الببتيد كاينين واختبارها من قبل لوحة فحص الكالسيوم تلألؤ بيولوجي (تانيجا – Bageshwar وآخرون ، 2006). وجدنا أن الأحماض الأمينية الفنيل ألانين 1 و 4 التربتوفان كانت ضرورية لنشاط الحشرات kinins لكل من المستقبلات. في مقايسة يمكن أن تستخدم أيضا لاختبار الببتيدات المصممة لتعزيز biostability. ويبين الجدول 2 النظير تصميم كاينين التي تحتوي على حمض أميني isobutyric (AIB) اختباره على مستقبلات القراد كاينين المؤتلف ويبين الشكل 2 مقارنة النشاط ستة ألفا الأمينية حمض isobutyric النظير على القراد مستقبلات كاينين معربا عن CHO – K1 خط خلية من الكالسيوم تلألؤ بيولوجي مقايسة لوحة (تانيجا – Bageshwar وآخرون ، 2009). يضاف hexapeptide التناظرية FFFSWGa لمراقبة إيجابية لنشاط مستقبلات. أدى التناظرية FF [AIB] WGA أكثر نشاطا من هذا التحكم التناظرية hexapeptide. كان التناظرية مع اثنين من البدلاء حمض aminoisobutyric ، [AIB] FF [AIB] WGA ، وأقوى من النظير المزدوج استبدال اختبار (الجدول 2 والشكل 2). لمزيد من الأمثلة عن كيفية هذا الاختبار قد تم ويمكن تطبيق رؤية نحمان وPietantonio (2010) ، نحمان وآخرون. (2009) ، تانيجا – Bageshwar وآخرون. (2008a) ، وتانيجا – Bageshwar وآخرون. (2008b). الشكل 1. تقدير الزاعجة kinins التركيز الفعال (EC 50) على الخلايا CHO K1 – E10 بواسطة فحص لوحة الكالسيوم تلألؤ بيولوجي. تم الحصول على المحور الصادي في منحنيات التركيز والاستجابة من وحدات تلألؤ بيولوجي كنسبة مئوية من الحد الأقصى لوحظ استجابة لكل الببتيد. نقاط البيانات تمثل المتوسط ستة يعيد تم الحصول عليها خلال ثلاث تجارب مستقلة. أشرطة تمثل الخطأ المعياري. (أ) تقدير Aedae – K1 EC 50 = 48 نانومتر. (ب) تقدير Aedae K2 – EC 50 = 26 نانومتر. (ج) تقدير Aedae K3 – EC 50 = 16 نانومتر. EC – 50 Aedae K3 <EC – 50 Aedae K2 <EC 50 Aedae – K1 ، P <0.05. والتحليل الإحصائي والرسوم البيانية مع برنامج بريزم 4.0 GraphPad. الشكل 2. مقارنة النشاط ستة ألفا الأمينية حمض isobutyric النظير على مستقبلات القراد كاينين معربا عن CHO – K1 خط خلية لوحة فحص الكالسيوم تلألؤ بيولوجي ، والمحور الصادي يمثل الوحدات في المئة تلألؤ بيولوجي القصوى لكل التناظرية كنسبة مئوية من تلألؤ بيولوجي لوحظ عند تركيز مقابل الاستجابة القصوى لوحظ بين جميع التركيزات اختبار لكل التناظرية. وأجريت التحليلات الإحصائية والرسوم البيانية مع بريزم GraphPad 4.0 البرمجيات. قراد مستقبلات خط الخلية خط البعوض مستقبلات الخلية </TR> الببتيد EC 50 (نانومتر) تلألؤ بيولوجي الاستجابة القصوى في 1 ملم EC 50 (نانومتر) تلألؤ بيولوجي الاستجابة القصوى في 1 ملم AFSWGa أنا أنا أنا أنا FASWGa 586 5600 ND 400 FFAWGa 64 12800 621 3050 FFSAGa أنا أنا أنا أنا FFSWAa 417 10600 2800 1830 FFSWGa 590 10800 ND 525 FSWGa أنا أنا أنا أنا FFSWa أنا أنا أنا أنا FFSWG – OH أنا أنا أنا أنا FFFSWGa 259 13000 562 10000 FF [AIB] WGA 29 12700 445 9300 الجدول 1. potencies المقدرة (EC 50) واستجابة القصوى تلألؤ بيولوجي من الببتيدات جميع اختبارها على القراد والبعوض مستقبلات الخلية خطوط transfected *. * وتشير تقديرات المفوضية الأوروبية 50 في التركيز المطلوب للحث على الاستجابة نصف القصوى. الأول : الاستجابة النشطة إذا تلألؤ بيولوجي أقل من 300 وحدة (مستوى ناقلات فقط خلايا transfected). ج : إن الموقف حيث تم استبدال بقايا منها في FFSWGa الببتيد بواسطة ألانين. ND : تم اختبار التناظرية ولكن إما غير نشطة جدا أو لم يكن أقل نشاطا في molarities ، وبالتالي لا يمكن أن تحدد أن هناك EC50. K – AIB – 1 [AIB] FF [AIB] WGA K – AIB – 2 [α MEF] FF [AIB] WGA K – AIB – 3 AC – R [AIB] FF [AIB] WGA K – AIB – 4 AC – R [β3F] FF [AIB] WGA K – AIB – 5 [AIB] RFF [AIB] WGA K – AIB – 6 [AIB – AIB – AIB – AIB] RFF [AIB] WGA الجدول 2. كاينين النظير (K) التي تحتوي على حمض أميني isobutyric (AIB) اختباره على مستقبلات القراد كاينين المؤتلف. ميلان : الاسيتيل ؛ α البيانات : α الميثيل فينيلالاناين ؛ β3F : β3 – فينيلالاناين ؛ أ : أميد.
Discussion
كنا قادرين على تنفيذ التوصيف الوظيفي لمستقبلات neuropeptide first اكتشف من العناكب (القراد والعث والعناكب) ، ومستقبلات كاينين القراد ، وذلك باستخدام هذا البروتوكول. هذا الأسلوب ثلاثة طلبات الابتدائي. أولا ، يمكن تطبيق هذه التقنية للمستقبل من خلال قياسات deorphanization النشاط يجند. ثانيا ، يمكن للمقايسة حل يجند مستقبلات العلاقات بين الهيكل والنشاط (ريال سعودي). ثالثا ، يمكن استخدام الأساليب في اكتشاف الأدوية. وعلاوة على ذلك ، يمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة نشاط منبهات أو الخصوم على GPCR أي تقريبا. بدأنا على التكيف مع هذا البروتوكول للفحص من المكتبات الصغيرة. خط خلية تستخدم نحن لا يعبر عن بروتين موجود في كل مكان G G 16. لم نكن بحاجة لأن المفصليات مستقبلات كاينين إشارة من خلال بروتين (جي كيو) وتتالي الكالسيوم داخل الخلايا والحفاظ على هذه الخصائص التي يشير في خلايا الثدييات كما هو موضح هنا.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الدكاترة. هي محل تقدير ويليامسون CJP Grimmelikhuijzen مايكل من جامعة كوبنهاغن (الدنمارك) لتوفير aequorin البلازميد. ومن المسلم به متعاون لدينا ، والدكتور رونالد J. نحمان من ARS – USDA (تكساس ، الولايات المتحدة) ، لتخليق الببتيد وتقديم للقارئ لوحة NOVOstar.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| DMEM | Invitrogen | ABCD1234 | |
| CHO-K1 cells | ATCC | CCL-61 | Manassas, VA, USA |
| F12K medium | Invitrogen | 21127 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F0643 | |
| Trypsin-EDTA (10x) | Invitrogen | 15400 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Invitrogen | 31985 | |
| Lipofectin Reagent | Invitrogen | 18292-011 | |
| GENETICIN | Invitrogen | 10131035 | |
| MC1061/P3 Ultracomp | Invitrogen | C663-03 | |
| QIAprep spin miniprep kit | Qiagen Inc. | 19064 | |
| FuGENE 6 Transfection reagent | Roche | 11 814 443 001 | |
| 96-well white thin bottom microtitere plate | Costar | 3610 | |
| calcium-free DMEM media | Invitrogen | 21068 | |
| Coelenterazine | Invitrogen | C-2944 | |
| Bright-Line Hemacytometer | Hausser Scientific | Horsham, PA | |
| NOVOstar | BMG Labtechnologies | ||
| Prism software 4.0 | GraphPad Software Inc. | San Diego, CA, USA | |
| T-25 and T-75 Flasks | BD Falcon | 353014 and 353135 |
References
- Kozak, M. An analysis of 5′-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs. Nucleic Acids Research. 15, 8125-8148 (1987).
- Nachman, R., Pietrantonio, P. V., Geary, T. Interaction of mimetic analogs of insect kinin neuropeptides with arthropod receptors. Neuropeptide systems as Targets for Parasite and Pest Control. , (2010).
- Nachman, R. J., Pietrantonio, P. V., Coast, G. M. Towards the development of novel pest management agents based upon insect kinin neuropeptide analogs. Annals of the New York Academy of Sciences. , 1163-11251 (2009).
- Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Isaac, R. E., Coast, G. M., Zubrzak, P., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. Biostable agonists that match and/or exceed the activity of insect kinins on recombinant arthropod GPCRs. General and Comparative Endocrinology. 162, 122-128 (2009).
- Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Kaczmarek, K., Zabrocki, J., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. Comparison of insect kinin analogs with cis-peptide bond, type VI-turn motifs identifies optimal stereochemistry for interaction with a recombinant arthropod kinin receptor from the southern cattle tick Boophilus microplus. Peptides. 29, 295-301 .
- Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Zubrzak, P., Williams, H., Reyes-Rangel, G., Juaristi, E., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. Identification of selective and non-selective, biostable beta-amino acid agonists of recombinant insect kinin receptors from the southern cattle tick Boophilus microplus and mosquito Aedes aegypti. Peptides. 29, 302-309 .
- Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Zubrzak, P., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. Comparative structure-activity analysis of insect kinin core analogs on recombinant kinin receptors drom southern cattle tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) and mosquito Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 62, 128-140 (2006).
- Pietrantonio, P. V., Jagge, C., Taneja-Bageshwar, S., Nachman, R. J., Barhoumi, R. The mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is a multiligand receptor for the three Aedes kinins. Insect Molecular Biology. 14, 55-67 (2005).
- Holmes, S. P., Barhoumi, R., Nachman, R. J., Pietrantonio, P. V. Functional analysis of a G protein-coupled receptor from the Southern cattle tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) identifies it as the first arthropod myokinin receptor. Insect Molecular Biology. 12, 27-38 (2003).
- Staubli, F., Jorgensen, T. J. D., Cazzamali, G., Williamson, M., Lenz, C., Sondergaard, L., Roepstorff, P., Grimmelikhuijzen, C. J. P. Molecular identification of the insect adipokinetic hormone receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 99, 3446-3451 (2002).
- Stables, J., Green, A., Marshall, F., Fraser, N., Knight, E., Sautel, M., Milligan, G., Lee, M., Rees, S. A bioluminescent assay for agonist activity at potentially any G-protein coupled receptor. Analytical Biochemistry. 252, 115-126 (1997).
Tags
Calcium Bioluminescence AssayFunctional AnalysisMosquitoAedes AegyptiTickRhipicephalus MicroplusG Protein-coupled ReceptorsArthropod Hormone ReceptorsPesticidesKinin ReceptorsNeuropeptidesStructure-activity RelationshipsHeterologous Kinin Receptor-expressing SystemsBiostable Kinin AnalogsDiuretic ProcessesMyotropic ProcessesDigestive ProcessesSouthern Cattle TickBoophilus MicroplusAedes AegyptiCHO-K1 Cell LineCalcium LevelsPeptide ApplicationRecombinant CellsAequorin Protein
Cite This Article
Lu, H., Kersch, C. N., Taneja-Bageshwar, S., Pietrantonio, P. V. A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors. J. Vis. Exp. (50), e2732, doi:10.3791/2732 (2011).