פליטת אור סידן Assay עבור ניתוח פונקציונלי של יתוש ( Aedes aegypti) ו טיק ( Rhipicephalus microplus) G-חלבון בשילוב רצפטורים

1. הקמתה של שורות תאים יציבות Clone GPCR העניין שלך ולהכניס אותו לתוך וקטור ביטוי שילוב קוזאק '5 רצף קונצנזוס (GCCA / GCCATGG) סביב קודון ההתחלה עבור מחייב ריבוזומלי אופטימלית במערכת יונקים (קוזאק, 1986). כאן אנו משתמשים pcDNA3.1/Bm-KR פלסמיד עבור קולטן סמן kinin, ואת pcDNA3.1/Aedae-KR פלסמיד עבור קולטן kinin יתוש (הולמס et al, 2003;. Pietrantonio et al, 2005).. PcDNA3.1 (-) וקטור מקודד התנגדות אמפיצילין עבור הבחירה חיידקים neomycin (G418) התנגדות לבחירה בתאי יונקים. לגדול CHO-K1 תאים ריקים (ללא פלסמידים) (ATCC, Manassas, VA, ארה"ב) או תאים אחרים קו הרצויה בבקבוק T-25 (BD פלקון) בשעה 37 ° C ב 5% CO 2 באינקובטור humidified (הולמס ואח' ., 2003). Incubations כל עוד צריך להיעשות בתנאים אלה אלא אם צוין אחרת. שמירה על תאים ריקים במדיום הגידול (המדיום F12K עם סרום 10% שור עוברי) עם 1X לאנטיביוטיקה Antimycotic (Invitrogen, CA). כדי לפצל תאים, לחמם את כל פתרונות 37 ° C. הסר בינוני הישן בבקבוק T-25 ולשטוף עם 5 מ"ל PBS ולאחר מכן להסיר PBS. כדי trypsinize התאים, להוסיף 2 מ"ל PBS-טריפסין-EDTA (34 מ"ל PBS, 2 מ"ל סודיום ביקרבונט 7.5%, 4 מ"ל 10X טריפסין-EDTA) במשך 2 דקות. הוסף 3 בינוני מ"ל לשאוב בינוני למעלה ולמטה כדי לערבב תאים. העברת בינוני עם תאים לתוך צינור חרוטי ו צנטריפוגות דקות 2 ב ~ 200-300 גרם (1,000 סל"ד). בטל supernatant מחדש להשעות תאים בינוניים 5 מ"ל. לדלל את התאים resuspended ריכוז של 1:05 או 1:10 עם מדיום חדש ולהעביר 5 מ"ל בבקבוק T-25 חדש. אחרי התאים גדלים בריא (כ 2-3 ימים), הזרע CHO-K1 תאים לתוך T-25 צלוחיות תרבות רקמות לגדל אותם ללון בינוני צמיחה ללא אנטיביוטיקה עד שהם ומחוברות כ -30% (כ 18 שעות). מידת confluency ניתן לקבוע על ידי התבוננות בתאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוכה. הכן את התערובות הבאות עבור כל דגימה: שלב 1-2 DNA מיקרוגרם (לדוגמה: 4μl השימוש 265μg/μl pcDNA3.1/Aedae-KR) עם 100 μl Opti-ממ אני מופחת סרום בינוני (Invitrogen). מערבבים 6 מגיב Lipofectin μl (InvitrogenTM) לתוך מדיום 100 μl בסרום F12K חינם, קבלת יחס של 1:01 Lipofectin ל-DNA. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30-45 דקות. בעדינות מערבבים את פתרונות 1.5.1 עם 1.5.2 בצורה טיפה חכם (הנפח הכולל = 200 μL). בואו לעמוד בטמפרטורת החדר למשך 10-15 דקות. הסר את מדיום הגידול הישן מן התאים לשטוף את התאים עם 5 בינוני מ"ל סרום F12K חינם ולאחר מכן להסיר את המדיום בסרום F12K חינם. בתוך שפופרת 15 מ"ל, לערבב בעדינות את התערובת לתוך transfection 1.8 מ"ל של מדיום F12K טרי בצורה טיפה חכם. לאחר מכן, לשטוף את התאים מן הצעד 1.5 עם PBS ולהוסיף את הפתרון הזה transfection חדש על התאים. דגירה של 18 שעות. שנה את בינונית עד F12K בינוני פלוס 10% בסרום שור עוברית ללא אנטיביוטיקה דגירה לילה. פצל את התאים לשתי T-25 צלוחיות עם F12K בינוני פלוס 10% בסרום שור עוברית ללא אנטיביוטיקה לעוד 18 שעות (עבור תאים פיצול אנא ראה שלב 1.3). החלף את בינוני עם בינוני סלקטיבית (בינוני F12K בתוספת 10% בסרום שור עוברית עם 800μg/ml GENETICIN, Invitrogen). התרבות התאים באמצעות מדיום סלקטיבית עבור 3-4 שבועות. במשך הזמן הזה יבחר עבור תאים שילבו ביציבות הפלסמיד לתוך הדנ"א הגנומי שלהם. המשך שמירה על תאים באמצעות תחזוקה בינוני (מדיום F12K בתוספת 10% בסרום שור עוברית עם 400μg/ml GENETICIN). מעת לעת להקפיא שורות תאים עם יחס של 1:01 התקשורת הקפאה (בינוני סלקטיבית עם DMSO 20%) כדי למנוע מאבד במקרה של זיהום בלתי צפוי. בחירת שורות תאים משובט: כצעד ראשון, trypsinize ו צנטריפוגות התאים משלב 1.8 עם המדיום תחזוקה כמו בשלב 1.3. Re-להשעות תאים בינוניים 5 מ"ל תחזוקה, לקחת 0.5 מ"ל של התא להשעות ומוסיפים 4.5 מ"ל של מדיום תחזוקה טריים לבצע דילול 10x. מעבירים את דילול 10x לתוך צלחת של 12 בארות 96 היטב, מוסיפים 100 μl היטב כל כדי לבחור עבור תאים בודדים. המשך לבצע דילולים סדרתי 10x של תאים אלה על ההשעיה הסופית התיאורטית של תא אחד לכל μl 100 (בדרך כלל הדילול הסופי יהיה בטווח של 10 -11 עד 10 -19, המספר הכולל של דילולים סדרתי 10x הוא ~ 19) . מיד לאחר דילול כל, להעביר 100 μl של דילול לתוך צלחת של 12 בארות 96 הבאר. לאחר דגירה 18 שעות, 96 צלחות לצפות גם תחת אור הפוכה או פלואורסצנציה מיקרוסקופ ו סימן בארות שנראים להכיל רק תא אחד בודד או מכילים שני תאים מחולק ברור מתא אחד בודד. שמור התבוננות בכל יום בינוני לשנות כל שלושה ימים. כאשר בארות הם conflu 80%אף אוזן גרון (כשבוע), לשטוף בארות המסומנים PBS 200 μl ו trypsinize אותם עם 100 μl של פתרון PBS-טריפסין-EDTA. העברת התאים מכל מסומנים היטב לתוך אחד טוב של צלחת 6-היטב עם 1 בינוני תחזוקה מ"ל. לגדל תאים אלה במשך 3 ימים ולאחר מכן להעביר לתוך בקבוק T25 תאים בודדים. בדיקת התאים האלה באמצעות פליטת אור סידן assay פפטידים עם אגוניסט (ראה סעיף 2). בחר קו 1 לתא משלב 1.11 עם התגובה הגבוה ביותר assay פליטת אור סידן הצלחת לבצע בפעם השניה הבחירה תא אחד הצעדים הבאים 1.9-1.11. מעת לעת להקפיא שורות תאים. מתוך מבחר המשני המתואר בשלב 1.12, לבחור 2-3 שורות תאים עם התגובה הגבוה ביותר assay פליטת אור סידן צלחת ולשמור אותם בתרבות להמשך מבחני פליטת אור סידן צלחת. עקוב אחר מספרי המעבר. מעת לעת, להקפיא שורות תאים מ קטעים מוקדם, כך שאתה תמיד יכול לחזור אליהם אם שורות תאים עם קטעים יותר להפסיק ביצוע עקבי. 2. פליטת אור סידן צלחת assay ולקשור את הגן הכתב עניין לתוך וקטור ביטוי. כאן השתמשנו mtAEQ/pcDNA1 aequorin פלסמיד (מתנה בני הזוג. CJP Grimmelikhuijzen ומיכאל וויליאמסון, באוניברסיטת קופנהגן, דנמרק). להפוך את הפלסמיד ב E. תאים coli MC1061/PS (Invitrogen) ולטהר אותם באמצעות ספין QIAprep miniprep Kit (Qiagen Inc). בשלב האחרון elute הפלסמיד עם טריס חיץ ללא EDTA, לא מים. לגדול שורות תאים מ – 1.13 צעד המבטא את הקולטן הרצוי בינוני תחזוקה. כאשר התאים הם 90% ומחוברות, trypsinize, צנטריפוגה ולאחר מכן מחדש להשעות את התאים בינוני 5 מ"ל תחזוקה כמו בשלב 1.3. מדולל תאים (10x על בינוני עם אחזקה) לספור מספר התא עם תא לדלפק (Bright-Line Hemacytometer) תחת מיקרוסקופ. התאם את מספר התא לכ 2 x 10 5 תאים / מ"ל (ממוצע 20 התאים אחד 9 ריבועים הראו ב Hemacytometer). 2 תאים Seed מ"ל מדולל בתקשורת לבאר כל צלחת שישה היטב. דגירה למשך 24 שעות (התאים אמורים להגיע כ -60% confluency לאחר דגירה). שינוי התקשורת בצלחת בארות 6 עד בינוני OPTI-ממ. עבור כל טוב, לערבב 96 μl OPTI-ממ עם 4 מגיב transfection μl 6 FuGENE (ביוכימיקלים רוש) בצינור microfuge ולהניח בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. הוסף 1 מיקרוגרם של ה-DNA 1 aequorin / pcDNA הפלסמיד לתוך צינור אחד, ואז ללחוץ בעדינות את המדגם עבור דק '1, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15-20 דקות. הוסף את כל התערובת היטב כל באופן dropwise בעוד בעדינות מטלטל את הצלחת היטב. דגירה הצלחות במשך 6 שעות ולשנות את F12K בינוני עד בינוני מכיל 10% בסרום שור עוברית ללא אנטיביוטיקה. לאחר דוגרים התאים בצלחת כמו שש ל -24 שעות, trypsinize, צנטריפוגה מחדש להשעות את התאים כצעד 1.3. ספירת התאים 400,000 תאים / מ"ל ​​כצעד 2.1 והעברת 100 μl (μl סך 40,000 cells/100) לתוך הבאר כל אחד 96-היטב צלחת לבנה רזה התחתונה microtitre (שחקן המשנה 3610). דגירה עוד 24 שעות עד confluency על 80% התא. זהו ריכוז אופטימלי של תאים assay פליטת אור. הכן 90μl/well של סידן ללא DMEM מדיה (Invitrogen) המכיל 5 coelenterazine מיקרומטר (Invitrogen) בחושך (coelenterazine הוא רגיש לאור). קחו את הצלחת 2.4, להסיר התקשורת הישנה להוסיף 90μl לבאר כל אחד. דגירה צלחות במשך 3 שעות בחושך ב 37 ° C ו 5% CO 2, לאחר מכן את התאים בצלחת מוכנים להיבדק. 3. כלי ניתוח וניתוח נתונים כל הקורא צלחת פליטת אור שונה. אנו מבצעים assay שלנו באמצעות קורא (Labtechnologies BMG) NOVOstar צלחת במצב bioluminensence. אם אתם משתמשים בכלי אחר, אתה חייב להתאים את פרוטוקול. טהר את הקורא צלחת משאבות (משאבות או PRIME) לפני השימוש. כבה את האור בחדר לפני לשים את הצלחת על בעל צלחת. לאחר מחזיק צלחת נסגר, להדליק את האור. Solubilize פפטידים (ב 1.5 מ"ל Eppendorf שפופרת) של סידן ללא מדיה DMEM. בחר את "עומק לשאוב" ו "קביעת עמדה" הפתרון פפטיד לפני השימוש. לאתגר את התאים μl 10 (10x) של ריכוזים שונים של פפטידים (FFFSWG-NH2, Aedes-K1-3, או הפפטיד הרצוי אחרים) ומיד להתחיל בהקלטת פליטת האור. אנחנו צריכים להגדיר את המכשיר כדי להקליט את פליטת האור (465 ננומטר) עבור כל טוב כל 2 שניות למשך זמן כולל של 50 שניות. הקפד לכלול שליטה חיובית כגון אנלוגי פעיל (אנלוגי FFFSWGa נעשה שימוש, Taneja-Bageshwar et al. 2009) ו שליטה שליליות כגון תאים וקטור transfected בלבד. השליטה שלילי יהיה צורך במהלך ניתוח הנתונים כדי לקבוע את הסף הבסיסי (ראה תוצאות נציג).הפפטיד קשור, פעיל ניתן גם להוסיף כביקורת שלילית. לאחר ריצה תושלם, לשטוף את המשאבה מכשיר (או משאבות PRIME) אז במקום מדגם הפפטיד הבא שלך. שמירת הנתונים לשטוף את משאבות שוב. טיפול נתונים: העברת נתונים של פליטת האור מבאר כל לתוך גיליון Excel נתונים של מיקרוסופט. הדבקת נתונים מ-Excel ל פריזמה תוכנה 4.0 מ GraphPad Software Inc (סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב). ריכוזי הפפטיד השונים הוא ציר ה-X יחידות פליטת אור הוא ציר Y. כדי לנרמל את הנתונים, העלילה עקומת יומן התגובה. בחר רגרסיה ליניארית עקומת בכושר ניתוח (המשוואה sigmoidal מנה תגובה עם שיפוע משתנה) כדי להשיג ריכוז בתגובה עיקולים על פפטיד זה. המגרשים בתוכנית ערכים בסופו של דבר והוא נותן את EC 50. כל ניסוי יש לחזור שלוש פעמים לניתוח נתונים. 4. נציג תוצאות: כאשר ביטוי CHO-K1 תאים, Aedes יתוש קולטן aegypti kinin התנהג כמו הקולטן multiligand והן מבחינה תפקודית הגיב ריכוזים נמוך כמו 1 ננומטר של שלושת endogenours Aedes kinins, Aedae kinins 1-3, נבדק בנפרד באמצעות פליטת אור סידן assay צלחת . איור 1 מראה כי צו בדרגת עוצמה שהושג היה Aedae-K-3> Aedae-K-2> Aedae-K-1, המבוסס על בהתאמה EC 50 ערכי Aedae-K-3, 16.04 nM; Aedae-K- 2, 26.6 ננומטר Aedae-K-1, 48.85 ננומטר, אשר היו שונים באופן משמעותי מבחינה סטטיסטית (p <0.05) (Pietrantonio et al. 2005). יש לנו גם השתמשו assay כדי לקבוע אילו שאריות kinin הם קריטיים עבור אינטראקציה הפפטיד קולטן kinin. חרקים פפטידים kinin לשתף pentapeptide בטרמינל C-המייצג את רצף מינימלי הנדרש עבור פעילות ביולוגית, המכונה גם ליבה. בלוח 1, הליבה אנלוגים kinin פפטיד היו מסונתז כסדרת תחליף אלאנין של kinin הליבה pentapeptide FFSWGa ונבדקו על ידי פליטת אור assay צלחת סידן (Taneja-Bageshwar et al. 2006). מצאנו כי חומצות אמינו Phe 1 ו TRP 4 היו חיוניים לפעילות של kinins חרקים הן עבור הקולטנים. Assay גם יכול לשמש כדי לבדוק פפטידים המיועדים biostability משופרת. טבלה 2 מראה את אנלוגים kinin מעוצב המכיל חומצה אמינו isobutyric (AIB) נבדק על קולטן סמן רקומביננטי kinin ו תרשים 2 מציג את ההשוואה הפעילות של שישה אלפא חומצה אמינית אנלוגים isobutyric על קולטן סמן kinin להביע CHO-K1 קו תאים על ידי סידן צלחת פליטת אור assay (Taneja-Bageshwar et al. 2009). Hexapeptide אנלוגי FFFSWGa נוסף עבור פקד חיובית עבור פעילות הקולטן. אנלוגי FF [AIB] WGA הביא פעיל יותר אנלוגי שליטה זו hexapeptide. אנלוגי עם שני מחליפים חומצה aminoisobutyric, [AIB] FF [AIB] WGA, היה החזק ביותר של החלפת פעמיים אנלוגים נבדק (לוח 2 ואיור 2). לדוגמאות נוספות של assay כמה זה כבר יכול להיות מיושם לראות נחמן Pietantonio (2010), נחמן et al. (2009), Taneja-Bageshwar et al. (2008a), ו-Taneja Bageshwar et al. (2008b). באיור 1. הערכת Aedes kinins ריכוז יעיל (EC 50) על CHO-K1 בתאים E10 ידי assay סידן פליטת אור צלחת. ציר y ב ריכוז בתגובה עקומות התקבל יחידות פליטת אור מבוטא כאחוז התגובה המקסימלי שנצפה עבור כל הפפטיד. נקודות הנתונים מייצגים את הממוצע של שישה משכפל שהושגו במהלך שלושה ניסויים עצמאיים. ברים מייצגים את שגיאת התקן. (א) שערוך Aedae-K1 EC 50 = 48 ננומטר. (ב) הערכת Aedae-K2 EC 50 = 26 ננומטר. (ג) הערכת Aedae-K3 EC 50 = 16 ננומטר. EC-50 Aedae K3 <EC 50 Aedae-K2 <EC 50 Aedae-K1, p <0.05. ניתוח סטטיסטי וגרפים היו עם תוכנת Prism 4.0 GraphPad. איור 2. השוואה פעילות של שישה אלפא חומצה אמינית אנלוגים isobutyric על קולטן סמן kinin להביע CHO-K1 קו תאים על ידי פליטת אור assay סידן צלחת. ציר y מייצג אחוז מקסימלי יחידות פליטת אור אנלוגי עבור כל מבוטא כאחוז של פליטת אור שנצפה בריכוז לעומת התגובה המקסימלי שנצפה בין כל ריכוזי נבדק אנלוגי אחד. ניתוח סטטיסטי וגרפים בוצעו באמצעות תוכנת Prism GraphPad 4.0. סמן את התא בשורה קולטן קולטן תא יתוש קו </tr> פפטידים EC 50 (ננומטר) פליטת אור תגובה מקסימלי על 1 מ"מ EC 50 (ננומטר) פליטת אור תגובה מקסימלי על 1 מ"מ AFSWGa אני אני אני אני FASWGa 586 5600 ND 400 FFAWGa 64 12,800 621 3050 FFSAGa אני אני אני אני FFSWAa 417 10,600 2800 1830 FFSWGa 590 10,800 ND 525 FSWGa אני אני אני אני FFSWa אני אני אני אני FFSWG-OH אני אני אני אני FFFSWGa 259 13,000 562 10,000 FF [AIB] WGA 29 12,700 445 9300 החוזקים משוער טבלה 1. (EC 50) ותגובה פליטת אור מקסימלי של כל נבדק על פפטידים סמן ואת הקולטן יתוש קווי transfected תא *. * EC 50 מעריכה את הריכוז הנדרש כדי לעורר תגובה חצי מקסימלי. אני: לא פעילה אם התגובה פליטת אור הוא פחות מ 300 יחידות (רמת וקטור רק תאים transfected). : המיקום שבו שאריות בהתאמה ב FFSWGa פפטיד הוחלף אלאנין. ND: אנלוגי נבדק אבל היה או לא היה מאוד פעיל או לא פעיל molarities נמוך יותר, ובכך EC50 לא ניתן לקבוע. K-AIB-1 [AIB] FF [AIB] WGA K-AIB-2 [Α MEF] FF [AIB] WGA K-AIB-3 AC-R [AIB] FF [AIB] WGA K-AIB-4 AC-R [β3F] FF [AIB] WGA K-AIB-5 [AIB] RFF [AIB] WGA K-AIB-6 [AIB-AIB-AIB-AIB] RFF [AIB] WGA טבלה 2. Kinin אנלוגים (K) המכילים חומצה אמינית isobutyric (AIB) נבדק על קולטן סמן רקומביננטי kinin. Ac: אצטיל; α אני: α-methyl פנילאלנין; β3F: β3-פנילאלנין;: אמיד.