Een Calcium Bioluminescentie Assay voor functionele analyse van Mosquito ( Aedes aegypti) En Tick ( Rhipicephalus MicroPlus) G eiwit-gekoppelde receptoren

1. Oprichting van stabiele cellijnen Kloon uw GPCR van rente en plaats deze in een expressievector voorzien van een 5 'Kozak consensus sequentie (GCCA / GCCATGG) rond het startcodon voor een optimale ribosomale binding in een zoogdier systeem (Kozak, 1986). Hier gebruiken we het plasmide pcDNA3.1/Bm-KR voor de teek kinine-receptor, en het plasmide pcDNA3.1/Aedae-KR voor de mug kinine receptor (Holmes et al., 2003;. Pietrantonio et al., 2005.). De pcDNA3.1 (-) vector ampicillineresistentie codeert voor selectie in bacteriën en neomycine (G418) weerstand voor selectie in zoogdiercellen. Grow CHO-K1 lege cellen (zonder plasmiden) (ATCC, Manassas, VA, Verenigde Staten) of andere gewenste cel lijn in een T-25 kolf (BD Falcon) bij 37 ° C in een 5% CO 2 bevochtigde incubator (Holmes et al. ., 2003). Alle verdere incubaties moet worden gedaan onder deze voorwaarden, tenzij anders aangegeven. Handhaaf de lege cellen in groei medium (F12K medium met 10% foetaal runderserum) met 1X antibiotica Antimycoticum (Invitrogen, CA). Op te splitsen cellen, warm-up van alle oplossingen tot 37 ° C. Verwijder oude medium in de T-25 kolf en spoel na met 5 ml PBS en verwijder PBS. Om trypsinize cellen, voeg 2 ml PBS-trypsine-EDTA (34 ml PBS, 2 ml 7,5% natriumbicarbonaat, 4 ml 10x trypsine-EDTA) voor 2 minuten. Voeg 3 ml medium en aspireren medium op en neer om cellen te mengen. Transfer medium met cellen in een conische buis en centrifugeer gedurende 2 minuten bij ~ 200-300 g (1.000 rpm). Gooi supernatant en resuspendeer cellen in 5 ml medium. Verdun de geresuspendeerde cellen tot een concentratie van 1:5 of 1:10 met vers medium en overdragen 5 ml in een nieuwe T-25 kolf. Nadat de cellen gezond groeien (ongeveer 2-3 dagen), het zaad van de CHO-K1 cellen in T-25 weefselkweekflessen en groeien ze 's nachts in de groei medium zonder antibiotica tot zij ongeveer 30% confluent (ongeveer 18 uur). De mate van confluentie kan worden vastgesteld door het observeren van cellen onder omgekeerde fluorescentie microscopie. Bereid de volgende mengsels voor elk monster: Combineer 1-2 pg DNA (bijvoorbeeld: gebruik 4μl van 265μg/μl pcDNA3.1/Aedae-KR) met 100 ul Opti-MEM ik Verminderde Serum Medium (Invitrogen). Mix 6 pl Lipofectin Reagent (InvitrogenTM) in 100 ul F12K serum-vrij medium, het maken van een 1:1 verhouding van Lipofectin aan DNA. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30-45 minuten. Meng de oplossingen van 1.5.1 met 1.5.2 in een druppelsgewijs fashion (totaal volume = 200 pi). Laten staan ​​bij kamertemperatuur 10-15 minuten. Verwijder de oude groei medium van de cellen en was de cellen met 5 ml F12K serum vrij medium en verwijder vervolgens de F12K serum vrij medium. In een 15 ml tube, meng de transfectie mengsel in 1,8 ml vers F12K medium in een drop-wijs mode. Dan waste de cellen van stap 1.5 met PBS en voeg deze nieuwe transfectie oplossing voor de cellen. Incubeer gedurende 18 uur. Verander het medium tot medium plus 10% foetaal runderserum F12K zonder antibiotica en 's nachts incuberen. Splitsen de cellen in twee T-25 flessen met F12K medium plus 10% foetaal runderserum zonder antibiotica voor een ander 18 uur (voor het splitsen van cellen zie stap 1.3). Vervang het medium met selectieve medium (F12K medium plus 10% foetaal runderserum met 800μg/ml Geneticine, Invitrogen). Cultuur van de cellen met behulp van de selectief medium voor 3-4 weken. Na verloop van tijd zal dit selecteren voor cellen die stabiel zijn opgenomen het plasmide in hun genoom DNA. Doorgaan met het onderhouden van de cellen met behulp van het onderhoud medium (F12K medium plus 10% foetaal runderserum met 400μg/ml Geneticine). Periodiek bevriezen cellijnen met 1:1 verhouding van bevriezing media (selectief medium met 20% DMSO) om verliest in geval van onvoorziene besmetting te voorkomen. Het selecteren van klonale cellijnen: als een eerste stap, trypsinize en centrifugeer de cellen van stap 1.8 met het onderhoud medium zoals in stap 1.3. Re-schorten cellen in 5 ml onderhoud medium, neem dan 0,5 ml van de cel te schorten en voeg 4,5 ml vers onderhoud medium om een ​​10x verdunning te maken. Breng de 10x verdunning in 12 wells van een 96 wells-plaat, het toevoegen van 100 pi aan elk goed om te selecteren op individuele cellen. Blijf 10x seriële verdunningen van deze cellen te maken voor een theoretische laatste schorsing van een cel per 100 pl (normaal gesproken de laatste verwatering zal in de orde van 10 -11 zijn om 10 -19, het totale aantal van 10x seriële verdunningen is ~ 19) . Onmiddellijk na elke verdunning, overdracht 100 ul van de verdunning in 12 putjes van de 96 wells plaat. Na 18 uur incubatie, in acht platen met 96 putjes onder een omgekeerde licht of fluorescentie microscoop en mark putten die lijken te bevatten slechts een enkele cel of twee cellen die duidelijk gescheiden van een enkele cel bevatten. Houd het observeren van elke dag en veranderen medium om de drie dagen. Als de putten 80% confluENT (ongeveer een week), spoel gemarkeerd putten met 200 ul PBS en trypsinize ze met 100 ul PBS-trypsine-EDTA-oplossing. Transfer cellen van elk gemarkeerd goed in een putje van een 6-well plaat met 1 ml onderhoud medium. Groeien die cellen gedurende 3 dagen dan overdracht cellen in individuele T25 fles. Test deze cellen met behulp van de calcium-bioluminescentie test met agonist peptiden (zie hoofdstuk 2). Selecteer een cellijn van stap 1.11 met de hoogste respons in het calcium-bioluminescentie plaat assay en uit te voeren voor de tweede keer de single celselectie volgende stappen 1.9-1.11. Periodiek bevriezen cellijnen. Vanaf de tweede selectie beschreven in stap 1,12, kies dan 2-3 cellijnen met de hoogste respons in het calcium-bioluminescentie plaat assay en te onderhouden in de cultuur voor meer calcium bioluminescentie plaat assays. Blijf op de hoogte van de passage nummers. Van tijd tot tijd, bevriezen cellijnen van de vroege passages, zodat u kunt altijd terug naar hen als de cellijnen met meer passages stop het consequent uitvoeren. 2. De calcium bioluminescentie plaat-test Afbinden van de reporter gen van interesse in een expressievector. Hier gebruikten we aequorine plasmide mtAEQ/pcDNA1 (een geschenk van Drs. CJP Grimmelikhuijzen en Michael Williamson, Universiteit van Kopenhagen, Denemarken). Transformeren het plasmide in E. coli-cellen MC1061/PS (Invitrogen) en zuiveren ze met behulp van een spin-QIAprep Miniprep kit (Qiagen Inc.) In de laatste stap elueren het plasmide met Tris-buffer, zonder EDTA, geen water. Grow cellijnen uit stap 1,13 uiting van de gewenste receptor in onderhoud medium. Wanneer de cellen zijn 90% confluent, trypsinize, centrifuge en vervolgens de cellen weer te schorten in 5 ml onderhoud medium zoals in stap 1.3. Verdunnen cellen (ongeveer 10x met het onderhoud medium) en tel het aantal cellen met cel teller (Bright-Line hemacytometer) onder microscopie. Stel het aantal cellen tot ongeveer 2 x 10 5 cellen / ml (gemiddeld 20 cellen in een van de negen vierkanten toonde in de hemacytometer). Seed 2 ml verdund cellen in de media in elk putje van een zes goed plaat. Incubeer 24 uur (de cellen moet ongeveer 60% confluentie bereikt na incubatie). Verandering media in de 6 putten plaat OPTI-MEM medium. Voor elke goed, mix 96 ul OPTI-MEM met 4 ul Fugene 6 Transfectie reagens (Roche Biochemicals) in een microfugebuis en laat zitten bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Voeg 1 ug van aequorine / pcDNA een plasmide DNA in elke buis en dan zachtjes het monster schudden gedurende 1 minuut, incuberen bij kamertemperatuur gedurende 15-20 minuten. Voeg elk mengsel in elk putje in een druppelsgewijze manier, terwijl zachtjes schudden van de wells plaat. Incubeer de platen gedurende 6 uur en verander het medium tot medium dat 10% foetaal runderserum zonder antibioticum F12K. Na het incuberen van de cellen in zes goed plaat gedurende 24 uur, trypsinize, centrifuge en resuspendeer de cellen als in stap 1.3. Tel het aantal cellen tot 400.000 cellen / ml als stap 2.1 en overdracht 100 pi (totaal 40.000 cells/100 pi) in elk putje van een 96-wells witte dunne bodem microtiterplaat (Costar 3610). Incubeer nog eens 24 uur tot ongeveer 80% confluentie cel. Dit is de optimale concentratie van cellen voor de bioluminescentie test. Bereid 90μl/well van een calcium-vrij DMEM medium (Invitrogen) met 5 uM coelenterazine (Invitrogen) in het donker (coelenterazine is gevoelig voor licht). Neem de plaat uit 2,4, verwijder de oude media en voeg deze 90μl in elk putje. Incubeer de platen gedurende 3 uur in het donker bij 37 ° C en 5% CO 2, waarna de cellen in de plaat staan ​​klaar om getest te worden. 3. Apparaat in werking en data-analyse Elke bioluminescentie plaat lezer is anders. Wij voeren onze test met behulp van een Novostar (BMG Labtechnologies) plaat-lezer in bioluminensence mode. Als u een ander instrument, moet u aan te passen het protocol. Spoel de plaat lezer pompen (of PRIME pompen) voor gebruik. Schakel het licht in de kamer voordat de plaat op de plaat houder. Zodra de plaat houder heeft gesloten, zet het licht aan. Oplosbaar te peptiden (in een 1,5 ml Eppendorf buis) in de calcium-vrij DMEM media. Stel de "Zuig Depth" en "Positie bepalen" van de peptide-oplossing voor gebruik. Daag de cellen met 10 pi (10x) van verschillende concentraties van de peptiden (FFFSWG-NH2, Aedes-K1-3, of andere gewenste peptide) en onmiddellijk beginnen met het opnemen van de lichtemissie. Wij hebben het instrument om de lichtemissie (465 nm) record voor elk putje om de 2 seconden voor een totale tijd van 50 seconden. Zorg ervoor dat u een positieve controle, zoals een actieve analoge (analoge FFFSWGa is gebruikt, Taneja-Bageshwar et al.., 2009) en een negatieve controle, zoals vector alleen getransfecteerde cellen bevatten. De negatieve controle nodig zal zijn tijdens de data-analyse aan de basislijn drempel (zie de vertegenwoordiger van resultaten).Een onafhankelijke, niet-actieve peptide kan ook worden toegevoegd als een negatieve controle. Na de run is voltooid, was het instrument pomp (of PRIME POMPEN), dan plaats je volgende peptide monster. Uw gegevens opslaan en opnieuw was de pompen. Data handling: Breng de gegevens van de lichtemissie uit elk putje in een Microsoft Excel-gegevens sheet. Plak de gegevens uit Excel naar Prism software 4.0 vanaf GraphPad Software Inc (San Diego, CA, USA). De verschillende peptide concentraties is de X-as en bioluminescentie-eenheden is de Y-as. Te normaliseren van de gegevens, plot een log-response curve. Selecteer een niet-lineaire regressie-curve fit analyse (sigmoïdale dosis-respons vergelijking met variabele helling) naar de concentratie-respons curves te verkrijgen voor elk peptide. Het programma plots de waarden in het einde en geeft de EG-50. Elk experiment moet drie keer worden herhaald voor data-analyse. 4. Representatieve resultaten: Uitgedrukt in CHO-K1-cellen, de mug Aedes aegypti kinine-receptor gedroeg zich als een multiligand receptor en functioneel gereageerd op de concentraties zo laag als 1 nM van de drie endogenours Aedes kinins, Aedae kinins 1-3, getest afzonderlijk met behulp van de calcium-bioluminescentie plaat-test . Figuur 1 laat zien dat de rangorde van de potentie verkregen was Aedae-K-3> Aedae-K-2> Aedae-K-1, gebaseerd op de respectieve EC 50-waarden van Aedae-K-3, 16.04 nM; Aedae-K- 2, 26,6 nM en Aedae-K-1, 48.85 nM, die statistisch significant verschillend (P <0.05) (Pietrantonio et al., 2005).. We hebben ook gebruik gemaakt van deze test om te bepalen welke kinine resten zijn van cruciaal belang voor de kinine peptide-receptor interactie. Insect kinine peptiden hebben een C-terminale pentapeptide dat de minimale sequentie die nodig zijn voor biologische activiteit, ook wel bekend als kern vertegenwoordigt. In tabel 1 zijn de kinine-peptide kern-analogen gesynthetiseerd als een Alanine vervanging serie van de kern van kinine pentapeptide FFSWGa en getest door een calcium-bioluminescentie plaat assay (Taneja-Bageshwar et al., 2006).. We vonden dat de aminozuren Phe 1 en Trp 4 waren essentieel voor de activiteit van het insect kinins voor beide receptoren. De test kan ook worden gebruikt om peptiden is ontworpen voor een verbeterde biostability test. Tabel 2 toont de ontworpen kinine analogen met amino isoboterzuur (AIB) getest op het vinkje recombinante kinine-receptor en Figuur 2 toont de activiteit vergelijking van zes alpha-amino isoboterzuur-analogen op de teek kinine receptor uitdrukken CHO-K1-cellijn door een calcium- bioluminescentie plate assay (Taneja-Bageshwar et al.., 2009). De hexapeptide analoge FFFSWGa is toegevoegd voor een positieve controle voor receptor-activiteit. De analoge FF [Aib] WGA resulteerde actiever dan dit hexapeptide controle analoog. De analoge met twee aminoisobutyric zuur vervangers, [Aib] FF [Aib] WGA, was de meest krachtige van de dubbele vervanging analogen getest (tabel 2 en figuur 2). Voor meer voorbeelden van hoe deze test is en kan worden aangebracht, zie Nachman en Pietantonio (2010), Nachman et al.. (2009), Taneja-Bageshwar et al.. (2008a), en Taneja-Bageshwar et al.. (2008b). Figuur 1. Schatting van Aedes kinins effectieve concentratie (EC 50) op CHO-K1 E10 cellen door een calcium-bioluminescentie plate assay. De y-as in de concentratie-respons curves werd verkregen van bioluminescentie eenheden uitgedrukt als een percentage van de maximale respons waargenomen voor elk peptide. Datapunten geven het gemiddelde van zes identieke monsters verkregen gedurende drie onafhankelijke experimenten. Staven geven de standaardfout. (A) Schatting van Aedae-K1 EC 50 = 48 nM. (B) Schatting van Aedae-K2 EC 50 = 26 nM. (C) Schatting van Aedae-K3 EC 50 = 16 nM. EC 50 Aedae-K3 <EC 50 Aedae-K2 <EC 50 Aedae-K1, P <0,05. Statistische analyse en grafieken waren met de GraphPad Prism 4.0 software. Figuur 2. Activiteit vergelijking van de zes alpha-amino isoboterzuur-analogen op de teek kinine receptor uitdrukken CHO-K1-cellijn door een calcium-bioluminescentie plaat-test. De y-as geeft procent maximale bioluminescentie eenheden voor elk analoge uitgedrukt als een percentage van de bioluminescentie waargenomen bij een concentratie ten opzichte van de maximale respons waargenomen bij alle concentraties getest voor elk analoog. Statistische analyse en grafieken werden uitgevoerd met GraphPad Prism 4.0 software. Tick-receptor cellijn Mosquito receptor cellijn </tr> Peptiden EC 50 (nM) Maximale bioluminescentie respons bij een mM EC 50 (nM) Maximale bioluminescentie respons bij 1 mM AFSWGa Ik Ik Ik Ik FASWGa 586 5600 ND 400 FFAWGa 64 12.800 621 3050 FFSAGa Ik Ik Ik Ik FFSWAa 417 10.600 2800 1830 FFSWGa 590 10.800 ND 525 FSWGa Ik Ik Ik Ik FFSWa Ik Ik Ik Ik FFSWG-OH Ik Ik Ik Ik FFFSWGa 259 13.000 562 10.000 FF [Aib] WGA 29 12.700 445 9300 Tabel 1. Geschatte potenties (EG 50) en de maximale bioluminescentie reactie van alle peptiden getest op de pof en de mug-receptor getransfecteerde cellijnen *. * De EG 50 schat de concentratie die nodig is om een half-maximale respons te induceren. I: Inactieve als bioluminescentie reactie is minder dan 300 eenheden (niveau van de vector-only getransfecteerde cellen). A: De positie waar de respectievelijke residu in het peptide FFSWGa is vervangen door alanine. ND: De analoge werd getest, maar was of niet erg actief of niet actief was op lagere molarities, waardoor een EC50 kon niet worden vastgesteld. K-AIB-1 [Aib] FF [Aib] WGA K-AIB-2 [Α MEF] FF [Aib] WGA K-AIB-3 Ac-R [Aib] FF [Aib] WGA K-AIB-4 Ac-R [β3F] FF [Aib] WGA K-AIB-5 [Aib] RFF [Aib] WGA K-AIB-6 [AIB-AIB-AIB-Aib] RFF [Aib] WGA Tabel 2. Kinine-analogen (K) met amino isoboterzuur (AIB) getest op het vinkje recombinante kinine receptor. Ac: acetyl; α Me: α methyl-fenylalanine, β3F: β3-fenylalanine, een: amide.